Dissecting the requirements for Hepatitis C Virus RNA synthesis using a minus strand replication system

Abstract

The presented research focuses on viral and cellular determinants of the Hepatitis C Virus (HCV) replication. In particular, a novel minus strand replication system was developed to study distinct aspects of the HCV minus strand synthesis initiation. The system enabled a revision of state-of-the-art requirements for the HCV antigenome synthesis when uncoupled from possibly overlapping functions in viral translation and/or plus strand synthesis. So far mainly addressing the genome RNA sequence and structural elements prerequisites, the system displays a universal potential for investigation of replication of other plus strand RNA virus genomes.HCV is a positive-sense single-stranded RNA virus that infects human hepatocytes and causes both acute and chronic hepatitis. The challenge of elimination of HCV as a public health threat is largely complicated by absence of an efficient vaccine and by rapid emergence of virus quasispecies resistant to the existing treatment. Therefore, novel approaches are required for further understanding of molecular mechanisms of the HCV life cycle. Development of the autonomous replicon and full-length HCV cell culture systems has enabled a substantial breakthrough in understanding of the HCV translation and replication. However, these systems allow analysis of cis-elements and trans-acting factors required for genome replication only in presence of both genomic ends. Thus, it remains unclear, whether an element identified in the annotated HCV genome exerts its function when physically present on the plus or the minus strand, or on both. Additionally, given an entangled nature of viral RNA and protein synthesis, a number of overlapping cis-elements cannot be assigned to a specific step of the viral life cycle. To overcome the above limitations, the minus strand replication system was designed to specifically focus on prerequisites for the HCV antigenome production.The system, which represents a set of replication constructs assembled in agreement with the current knowledge on the HCV replication, uncouples to various extents the HCV minus strand synthesis from the plus strand synthesis and translation, thereby empowering diversified applications. The very 5 -end of the annotated HCV genome constituted by the stem-loop (SL) I and II domains was confirmed to be essential for the minus strand synthesis initiation at the genomic 3 -end. The positive regulation of the antigenome production was found to extend up to inclusion of the SL III domain; however, enabling of functional translation initiation from the HCV internal ribosome entry site (IRES) resulted in a profound negative effect on RNA replication. The latter observation has encouraged in-depth analysis of a balance between the HCV genome translation and replication that suggested an importance of the genomic RNA ends communication. Yet lacking an experimental confirmation, a possible circularization of the HCV RNA for efficient replication is supported by the importance of long-range RNA-RNA interactions between cis-elements, which were addressed by mutational analysis. Along with validation of the previously reported regulatory RNA elements, a comprehensive screening for cis-acting replication elements within the protein-coding sequence was undertaken. In addition to addressing the genome sequence and structure determinants, the minus strand replication system was utilized to examine a regulation of the HCV RNA synthesis by selected cellular factors. A positive role of the most of the liver-specific microRNA-122 (miR-122) binding sites on efficiency of the HCV minus strand synthesis initiation was demonstrated.In conclusion, an assay system for the specific analysis of requirements for the HCV minus strand RNA synthesis was developed. Uncoupling of the HCV minus and plus strand replication from each other and from translation enabled a dissection of essential cis-elements and assignment of their functions specifically to antigenome synthesis. Ultimately, the versatility of the system enables further characterization of regulatory trans-factors and investigation of the interplay of molecular processes during the HCV life cycle as well as of other RNA viruses. Diese Arbeit befasst sich mit viralen und zellulären Voraussetzungen der Hepatitis-C-Virus (HCV) Replikation. Ein neuartiges Minusstrang-Replikationssystem wurde entwickelt, um spezifische Aspekte der Initiation der Minusstrangsynthese zu untersuchen. Dieses System ermöglicht eine genaue Betrachtung der Voraussetzungen für die HCV Antigenom-Synthese, wenn diese nicht mit potentiell überlappenden Funktionen der Positiv-Strang-Synthese und/oder der viralen Translation gekoppelt ist. Dadurch besteht ein hohes Potential, dieses System als Modell für Untersuchungen der Replikation anderer Positivstrang-RNA-Viren Genomen zu verwenden, da es hauptsächlich die Erfordernisse der RNA-Genomsequenz sowie strukturelle Elemente einbezieht.HCV ist ein einzelsträngiges RNA-Virus positiver Polarität, welches menschliche Hepatozyten infiziert und sowohl akute als auch chronische Hepatitis verursacht. Die Herausforderung der Bekämpfung von HCV als Gefahr für die öffentliche Gesundheit wird durch das Fehlen eines wirksamen Impfstoffs und das schnelle Auftreten von Virus-Quasispezies, die gegen die bestehende Behandlung resistent sind, erheblich erschwert. Daher sind neue Ansätze erforderlich, um die molekularen Mechanismen des HCV-Lebenszyklus besser zu verstehen. Die Entwicklung autonomer Replikon- und HCV-Zellkultursysteme mit Genomen in voller Länge ermöglichte einen wesentlichen Durchbruch beim Verständnis der HCV Translation und Replikation. Allerdings ermöglichen diese Systeme die Analyse von cis-Elementen und trans-wirkenden Faktoren, welche auf die Genomreplikation nur in Gegenwart beider Genomenden wirken. Somit bleibt unklar, ob ein Element, welches im HCV-Genom identifiziert wurde, seine Funktion ausübt, wenn es physikalisch auf dem Plusstrang oder auf dem Minusstrang, oder auf beiden liegt. Angesichts der komplexen Natur der viralen RNA- und Proteinsynthese können überlappendende cis-Elemente nicht einem spezifischen Schritt des viralen Lebenszyklus zugeordnet werden. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein Minusstrang-Replikationssystem entwickelt, um speziell die Voraussetzungen für die HCV-Antigenom-Produktion zu untersuchen.Dieses System, welches eine Reihe verschiedener Replikationskonstrukte beinhaltet, die in Überein-stimmung mit dem aktuellen Verständnis der HCV-Replikation zusammengestellt wurden, entkoppelt die HCV-Minusstrangsynthese von der Plusstrangsynthese und der Translation, wodurch vielfältige Anwendungsmöglichkeiten bestehen. Das 5 -Ende des HCV-Genoms, welches aus den Stem-Loop (SL) I- und II-Domänen besteht, wurde als essentiell für die Initiation der Minusstrangsynthese am genomischen 3 -Ende bestätigt. Die Region, die für den positive Einfluss auf die Antigenom-Produktion verantwortlich ist, schließt die SL III-Domäne mit ein, jedoch führte die Einführung funktioneller Translationsinitiation durch die HCV interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) zu einem negativen Effekt auf die RNA-Replikation. Aufgrund dieser Beobachtung wurde eine eingehende Analyse des Gleichgewichts zwischen HCV-Genom-Translation und -Replikation durchgeführt, welche eine Interaktion zwischen den beiden genomischen RNA-Enden nahelegt. Obwohl bisher nicht experimentell bestätigt, spricht viel dafür, dass das HCV-Genom zirkularisiert, um effizient zu replizieren. Die Signifikanz der vorhergesagten RNA-RNA-Interaktion zwischen cis-Elementen über weite Distanzen wurde durch eine Mutationsanalyse überprüft. Neben zuvor beschriebenen regulatorischen RNA-Elementen wurde zusätzlich eine umfassende Suche nach cis-aktiven Replikationselementen innerhalb der Protein-kodierenden Sequenz durchgeführt. Zusätzlich zur Untersuchung der Genomsequenz und von Strukturelementen wurde das Minusstrang-Replikationssystem verwendet, um eine Regulation der HCV-RNA-Synthese durch ausgewählte zelluläre Faktoren zu untersuchen. Eine wichtige Rolle der meisten Bindesstellen der leberspezifischen microRNA-122 (miR-122) auf die Effizienz der HCV Minusstrangsynthese-Initiation wurde gezeigt.Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit ein experimentelles System für die Analyse von spezifischen Anforderungen für die HCV-Minusstrang-RNA-Synthese entwickelt. Die Entkoppelung der HCV-Minus- und Plusstrangreplikation voneinander und von der viralen Translation ermöglichte eine präzise Analyse wichtiger cis-Elemente und ihrer spezifischen Funktionen bei der Antigenomsynthese. Letztlich ermöglicht die Vielseitigkeit dieses Systems eine Charakterisierung von regulatorischen trans-Faktoren und die Untersuchung des Zusammenspiels molekularer Prozesse während des HCV-Lebenszyklus sowie bei anderen RNA-Viren.