Entwicklung einer Behandlungsstrategie für ein Maus-Modell der X-chromosomalen Retinitis Pigmentosa

Abstract

Die X-chromosomale Retinitis Pigmentosa (XLRP) wird häufig durch Mutationen im Exon ORF15 des Retinitis Pigmentosa GTPase Regulator (RPGR)-Gens verursacht. Die Gentherapie mittels RNA-Interferenz (RNAi) und das gene targeting sind mögliche Behandlungsstrategien. Diese Strategien wurden in Zellkultur und teilweise an einem XLRP Mausmodell getestet. Das XLRP Mausmodell beinhaltet eine pathologische Mutation, zwei stille Mutationen im ORF15 Exon sowie eine I-SceI-Erkennungssequenz. Eine HEK293-ORF15mut-Zelllinie, die die identischen Mutationen zum B6J.SV129-Rpgrtm1stie-Mausmodell besitzt, wurde generiert und für die Zellkulturversuche verwendet. Die Plasmide für vier verschiedene siRNAs (short interfering RNAs) wurden hergestellt und in HEK293-ORF15mut-Zellen transfiziert. GFP positive Zellen wurden 24 Stunden später durch FACS angereichert. Die RNA wurde isoliert und durch quantitative PCR (qPCR) bezüglich Herabregulierung der ORF15-Genexpression analysiert. Ein Westernblot mit einem spezifischen Rpgr-ORF15mut-Antikörper wurde durchgeführt, um die Ergebnisse auf Proteinebene zu validieren. Nach Klonierung der I-SceI-Sequenz vor das Reportergen gfp (Grün fluoreszierendes Protein) wurde dieses in HEK293-ORF15mut-Zellen teilweise unter Zugabe eines Templates transfiziert, GFP positive Zellen wurden durch FACS angereichert und die Doppelstrangbruch (DSB)-Reparatur durch den SURVEYOR-Assay, Verdau durch HindIII und Sequenzanalysen nachgewiesen. Durch subretinale Injektion wurden AAV-Vektoren, die die genome-editing-Tools beinhalten im B6J.SV129-Rpgrtm1stie-Mausmodell getestet. Die Analyse erfolgte identisch zu den Zellkulturversuchen.Durch die shRNA-Transfektion kam es zu einer maximalen Herabregulierung von 57 % des Rpgr-ORF15mut-Transkripts in der qPCR-Analyse. Der Westernblot zeigte keine Proteinproduktion in HEK293-Zellen. Die Transfektion der HEK293-ORF15mut-Zelllinie mit dem I-SceI-GFP-Plasmid zeigte 55 % NHEJ-Aktivität nach FACS-Anreicherung und maximal 19 % NHEJ in vivo nach subretinaler Injektion. Die homologe Rekombination zeigte eine Effizienz von 32 % in Zellkultur und konnte auch in vivo nachgewiesen werden. RNA-Interferenz und genome editing sind erfolgversprechende Strategien für die Verwendung im ORF15-Lokus in Zellkultur. Die RNA-Interferenz gilt es im Zusammenspiel mit der Genaddition in Zellkultur und in vivo zu testen. Erste Ergebnisse zeigen einen Erfolg hinsichtlich des genome editings in Photorezeptoren der Maus. Die Effizienz der homologen Rekombination muss noch verbessert werden. X-linked Retinitis Pigmentosa (XLRP) is most often caused by mutations in the exon ORF15 of the retinitis pigmentosa GTPase regulator (RPGR) gene. Gene therapy using RNA-interference (RNAi) and gene targeting may be used as treatment approaches. In this project, these strategies were tested in a cell culture model and partly in a XLRP mouse model. The XLRP mouse model contains a pathologic mutation, two silent mutations in the ORF15 exon and an I-SceI recognition site. A HEK293-ORF15mut cell line, containing the mutations identical to the B6J.SV129-Rpgrtm1stie mouse, was generated and used for cell culture experiments. Four different siRNAs (short interfering RNAs) were created and transfected into the HEK293-ORF15mut cell line. GFP positive cells were sorted 24 hours later by FACS. RNA was isolated and analyzed by quantitative PCR (qPCR) for downregulation of RPGR-ORF15 expression. A Western blot with a specific RPGR-ORF15 antibody was done to validate the results regarding protein level. I-SceI cDNA sequence was cloned into a bicistronic expression cassette together with the GFP cDNA. The plasmid was transfected into the HEK293-ORF15mut cell line, partly together with a Template. GFP positive cells were sorted 48 hours later by FACS and double strand break (DSB) repair events were analyzed using the SURVEYOR assay, HindIII digestion and Sanger sequencing analysis. AAV-vectors containing the genome editing tools were tested in the B6J.SV129-Rpgrtm1stie mouse model by subretinal injection. The analysis was done identical to the experiments in cell culture. ShRNA transfection caused 57% downregulation of the RPGR-ORF15 transcript in HEK293-ORF15mut cells by the most efficient variant measured by qPCR. No protein production was detected by Westernblot in HEK293 cells. Following transfection of the HEK293-ORF15mut cell line with the I-SceI-GFP plasmid, up to 55% showed NHEJ compared to 19% NHEJ in vivo after subretinal injection. Homology directed repair efficiency was up to 32% in cell culture and was also detectable in vivo. RNA-interference and genome editing are both promising strategies at the ORF15 locus in cell culture. RNA-interference should be tested in combination with gene addition in cell culture and in vivo. First results were successful regarding genome editing in murine photoreceptors in vivo. The efficiency of homology directed repair needs to be improved.