Genexpressionsstudien zur Etablierung der adulten murinen organotypischen Retinakultur als Modell für gentherapeutische Ansätze

Abstract

Zu den retinalen neurodegenerativen Erkrankungen zählt u.a. Retinitis Pigmentosa, eine Gruppe von erblichen retinalen Krankheiten, bei denen es durch das Absterben von Photorezeptoren zu einer Netzhautdegeneration kommt. Genome Editing stellt an dieser Stelle eine vielversprechende Therapiemöglichkeit dar. Durch den Einsatz hochspezifischer Nukleasen, die einen gezielten DSB in die DNA einfügen, kann mit Hilfe eines gesunden exogenen DNA-Templates das mutierte Gen ausgetauscht werden. Um die Anwendung und das Potenzial der Gentherapien zu überprüfen, bevor es am gesamten Organismus, der Maus, getestet wird, sollen organotypische Retinakulturen zum Einsatz kommen. Diese stellen ein Modellsystem dar, das physiologisch nah an der in vivo Situation ist, da neuronale Interaktionen der verschiedenen Zelltypen und schichten erhalten bleiben. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Genexpression von DNA-Reparaturproteinen in der organotypischen Retinakultur von adulten Wt-, Rpgr conditional knock-out (B6J.Sv129-Rpgrtm1Sti) und Lbr2 knock-in Mäusen untersucht werden. Ziel war es eine Grundlage zu schaffen, diese Methode als Modellsystem für das Studium gentherapeutischer Anwendungen zu etablieren und den Status der DNA-Reparaturmechanismen aufzuklären. Dazu wurden Netzhäute von adulten Wildtyp-, Rpgr-, und Lbr2-Mäusen bis zu acht Tage in Kultur genommen die Genexpression mittels qPCR untersucht. Es wurden ganze Netzhäute oder einzelne retinale Schichten, nach Lasermikrodissektion, zur Analyse verwendet. Bei den Analysen standen die NHEJ-Gene 53bp1, Ku80 und DNA-PKcs sowie die HDR-Gene CtIP, Rad50 und Brca1 im Fokus. Die Untersuchungen ergaben, dass die Kulturbedingungen durchaus einen großen Einfluss auf den allgemeinen Zustand der Retina haben, was sich durch starken Verlust des RNA-Gehalts auswirkt. Es zeigte sich zudem eine starke Abnahme der Rhodopsin-Expression, was vermutlich auf den Verlust zahlreicher Außensegmente der Photorezeptoren und des RPE zurückzuführen ist. Die starke Zunahme der Expression von Glia-spezifischen Genen weist auf eine Gliose in der Retinakultur hin. Die nahezu unveränderten Expressionsraten der NHEJ Reparaturgene in den Untersuchungen der gesamten Retina könnte ein Indiz für die reduzierte Effizienz der Reparatur von DSB in den Photorezeptoren sein. Es gibt Hinweise darauf, dass MMEJ einen möglichen alternativen Reparaturweg in der Retina darstellt. Der Vergleich der drei Mauslinien untereinander zeigte keine signifikanten Unterschiede. Es wurde jedoch gezeigt, dass eine Zellschicht-spezifische Analyse der Expression der Retina nötig ist, um eine detaillierte Grundlage für geplante Genome Editing Therapien zu schaffen. Durch die hier geleisteten Expressionsanalysen, zusammen mit den histologischen Untersuchungen durch Müller et al. (2017) lässt sich postulieren, dass die organotypische Retinakultur bis etwa zum achten Tag der Kultur für die gentherapeutische Anwendung genutzt werden kann. Sie könnte somit dazu beitragen, die gentherapeutischen Ansätze zu optimieren, bevor sie in vivo im Tierversuch angewendet werden. Dies soll auch zu einer deutlich niedrigeren Zahl an Versuchstieren beitragen.