Die Rolle von Epoxyeicosatriensäuren in der protrahierten hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion

Abstract

Die hypoxische pulmonale Vasokonstriktion (HPV) ist eine physiologische, intrinsische Reaktion in pulmonalen Arterien, die den Blutfluss von schlecht belüfteten Azini zu besser ventilierten Arealen der Lunge umleitet, um so den Gasaustausch zu optimieren. Bei langanhaltender, generalisierter Hypoxie, z.B. hervorgerufen durch Lungen- oder neuromuskuläre Erkrankungen oder durch einen Aufstieg in großer Höhe, trägt eine verstärkte protrahierte HPV zur Entwicklung einer pulmonalen Hypertonie (PH) und einem Rechtsherzversagen bei. Bisherige Therapien gegen PH lindern die Symptome, versprechen jedoch keine Heilung und sind zudem mit starken Nebenwirkungen verbunden. In Anbetracht dessen ist es wichtig, ein weiteres Verständnis für die zu Grunde liegenden physiologischen Mechanismen der HPV zu erlangen, um neue therapeutische Strategien entwickeln zu können. Frühere Studien zeigen, dass die protrahierte HPV durch einen bisher unbekannten Vasokonstriktor, welcher in pulmonalen Arterien freigesetzt wird, induziert wird. Vermutlich handelt es sich dabei um Metabolite der Cytochrom-P450 (CYP)-Epoxygenase, sogenannte Epoxyeicosatriensäuren (EETs). Das Ziel der vorliegenden Thesis war es, die Involvierung von EETs in der protrahierten HPV zu untersuchen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde das Modell der HPV in isolierten, pulmonalen Arterien der Maus etabliert. Dabei konnte gezeigt werden, dass kleine intrapulmonale Arterien (IPAs; 80-200 mikrometer im Durchmesser), jedoch nicht große intrapulmonale Arterien (450-650 mikrometer) oder extrapulmonale Arterien (EPAs; 500-700 mikrometer), eine protrahierte, sich langsam entwickelnde HPV aufweisen. Die Reaktion auf Hypoxie war unabhängig von der Anwesenheit des Endothels und konnte durch eine Vorstimulierung der Arterien mit Kaliumchlorid potenziert werden. Von sieben Isoformen der EET-produzierenden CYP2JEpoxygenasen wurden sechs in den IPAs aus Mäusen exprimiert. Die pharmakologische Inhibition der EET-Synthese, durch MS-PPOH oder durch den knockdown der CYP2JIsoformen, unterdrückte die HPV in den kleinen IPAs aus Mäusen. Zudem wurde die protrahierte HPV durch den EET-Antagonisten 14,15-EEZE in den kleinen IPAs aus Mäusen und in isolierten, perfundierten und ventilierten Mäuselungen aufgehoben. Die HPV wurde durch den knockdown des EET-degradierenden Enzyms, der löslichen Epoxidhydrolase (sEH), oder in Anwesenheit des sEH-Inhibitors (TPPU) verstärkt. Die exogene Applikation der EETRegioisomere (5,6-, 8,9-, 11,12-, 14,15-EET) hatte keinen Effekt auf die Wandspannung in Abwesenheit eines pretones, verursachte jedoch eine Dilatation der IPAs in Anwesenheit eines U46619-induzierten pretones. Im Gegensatz dazu verursachte 5,6-EET, aber kein anderes Regioisomer, in Anwesenheit eines Kaliumchlorid-induzierten pretones eine biphasische Kontraktion der IPAs und eine Erhöhung des pulmonalarteriellen Drucks in isolierten Mäuselungen. Zu beachten ist, dass 5,6-EET keine Kontraktion in isolierten Segmenten der Aorta und der Femoralarterien induzieren konnte.Vor kurzem wurde gezeigt, dass die HPV entscheidend von einer Inhibition der spannungsabhängigen Kaliumkanäle in pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen (PASMCs) abhängig ist, welche unter Hypoxie durch eine Cytochrom C Oxidase Untereinheit 4 Isoform 2-vermittelte Erhöhung der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies entsteht. In der vorliegenden Studie wurde gezeigt, dass Wasserstoffperoxid oder der Inhibitor für spannungsabhängige Kaliumkanäle, namens 4-Aminopyridin (4-AP), allein in der verwendeten Konzentration keinen Effekt auf den Tonus der IPAs haben. Jedoch führte 5,6-EET in Anwesenheit von einer der beiden Substanzen zu einer signifikanten Kontraktion. Die Reaktion auf 5,6-EET in IPAs, die mit 4-AP vorstimuliert wurden, wurde komplett durch den L-Typ-Calciumkanal-Antagonisten Nifedipin inhibiert. In den Patch Clamp-Experimenten induzierte Hypoxie eine Depolarisation in PASMCs. Die Applikation von 5,6-EET führte zu Whole Cell-Einwärtsströmen in PASMCs, die auf das hypoxische Niveau depolarisiert wurden, aber nicht in deren Ruhemembranpotential, welches unter normoxischen Bedingungen gegeben ist. Außerdem führte 5,6-EET in depolarisierten IPAs zu einer Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die protrahierte HPV in IPAs aus Mäusen durch eine Aktivierung der EET-Synthese vermittelt wird. Unter allen anderen EETs scheint 5,6-EET spezifisch eine Rolle in der protrahierten HPV zu spielen, da nur dieses Regioisomer in der Lage war eine Kontraktion von IPAs auszulösen. Die generierten Daten lassen vermuten, dass die Depolarisation in PASMCs, welche unter Hypoxie auftritt, der Schlüsselfaktor für die vasokontrahierende Antwort auf 5,6-EET ist. Womöglich fördert 5,6-EET den Eintritt von Calcium über L-Typ-Calcium-Kanäle. Der exakte Mechanismus dieser Reaktion, sowie die beitragenden Faktoren zur Aktivierung der EETSynthese unter Hypoxie sollten in weitergehenden Untersuchungen adressiert werden. Die eigenen Ergebnisse schaffen Ansatzpunkte für weitere Studien zur Rolle des EETSignalwegs in der Entwicklung der Hypoxie-induzierten pulmonalen Hypertonie. Hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV) is a physiological reaction intrinsic to pulmonary arteries, which redirects blood flow from poorly ventilated acini to well ventilated areas of the lung in order to optimize pulmonary gas exchange. However, in cases of prolonged generalized hypoxia, caused e.g. by lung or neuromuscular diseases or at high altitude, exaggerated sustained HPV contributes to the development of pulmonary hypertension (PH) and right heart failure. Current treatment options can help to ameliorate PH symptoms, but they provide no cure and are often associated with significant side effects. In view of this, further understanding of the underlying physiological mechanisms of HPV is important for the development of novel therapeutic strategies. Earlier reports indicate that sustained HPV may be induced by a yet unidentified vasoconstrictor, which is released in pulmonary arteries. It has been suggested that this factor may be a cytochrome P450 (CYP) epoxygenase-derived arachidonic acid metabolites, epoxyeicosatrienoic acids (EETs). The aim of the thesis was to investigate the involvement of EETs in sustained HPV. In order to achieve the aim, the model of HPV in isolated mouse pulmonary arteries was established. It was found that small intrapulmonary arteries (IPAs, 80 200 micrometer in diameter), but not large intrapulmonary arteries or extrapulmonary arteries (450 650 and 500 700 micrometer), exhibit sustained, slowly developing HPV. This hypoxic response was not dependent on the presence of intact endothelium and could be potentiated by precontraction of IPAs with potassium chloride. Six out of seven isoforms of EET-producing CYP2J epoxygenases were found to be expressed in mouse IPAs. The pharmacological inhibition of EET synthesis with MS-PPOH or deficiency of CYP2J isoforms suppressed HPV in small IPAs. Furthermore, an EET antagonist 14,15-EEZE abolished sustained HPV in small IPAs and isolated perfused and ventilated mouse lungs. HPV in IPAs was enhanced by knockdown of the EET-degrading enzyme the soluble epoxide hydrolase (sEH) or in the presence of sEH inhibitor (TPPU). Application of exogenous EET regioisomers (5,6-, 8,9-, 11,12-, 14,15-EET) had no effect in the absence of pretone, but provoked relaxation in the presence of U46619-precontracted IPAs. In contrast, in the presence of potassium chloride-induced pretone, 5,6-EET, but not other regioisomers, caused a biphasic contraction in IPAs and an increase in pulmonary artery pressure in isolated mouse lungs. Of note, 5,6-EET was not able to elicit contraction in isolated aorta and femoral artery segments.It has been shown recently that HPV is critically dependent on inhibition of voltage-gated potassium channels in pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) induced in hypoxia by an cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 2-mediated increase in reactive oxygen species production. In the present study, it has been found that hydrogen peroxide and a voltage-gated potassium channel inhibitor, called 4-aminopyridine (4-AP), had no effect on IPA tone alone at their applied concentrations. However, in the presence of each of those agents, 5,6-EET induced significant contraction. The response to 5,6-EET in IPAs pretreated with 4-AP was completely abolished by L-type calcium channel antagonist nifedipine. In patch clamp experiments, hypoxia induced depolarization in PASMCs. The application of 5,6-EET evoked inward whole cell currents in the cells depolarized to the hypoxic level, but not at their resting membrane potential, which is given under normoxic conditions. Furthermore, 5,6-EET evoked an increase in intracellular calcium concentration in depolarized IPAs. In conclusion, the obtained results indicate that sustained HPV in mouse IPAs is mediated by activation of EET synthesis. Among all EETs, 5,6-EET specifically appears to be responsible for HPV, as only this regioisomer was able to cause contraction in IPAs. The obtained data suggest that depolarization in PASMCs, which occurs in hypoxia, is the key factor that enables vasoconstrictor response to 5,6-EET. It may be speculated that 5,6-EET facilitates calcium entry via L-type channels. The exact mechanisms of this response as well as the factors contributing to the activation of EET formation in hypoxia remain to be investigated. The own findings provide a basis for future studies on the role of the EET signaling pathway in the development of hypoxia-induced pulmonary hypertension.