MotL ist ein c-di-GMP-abhängiger negativer Regulator des lateralen Flagellensystems in Shewanella putrefaciens CN-32

Abstract

Der Modellorganismus Shewanella putrefaciens CN-32 besitzt zwei distinkte Flagellencluster, die ein polares Flagellum und bis zu fünf zusätzliche laterale Flagellen ausbilden können. Beide Flagellensysteme sind dabei voll funktional und voneinander unabhängig. Es ist eine Vielzahl an posttranslationalen Regulationsmechanismen bekannt, die den Flagellenmotor beeinflussen, um die Flagellenleistung zu steigern oder herabzusetzen. Häufig handelt es sich dabei um Motorbremsen oder molekulare Kupplungen, die in Abhängigkeit der intrazellulären c-di-GMP-Konzentration in ihrer aktiven oder inaktiven Form vorliegen und ihre regulatorische Funktion übernehmen. Der Botenstoff c-di-GMP spielt also eine wichtige Rolle bei der Regulation der Motilität und reguliert unter anderem die Transition von motil zu sessil. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das PilZ-Domänenprotein MotL (SputCN32_3446) in S. putrefaciens CN-32 als negativer Regulator des lateralen Flagellensystems agiert und die Funktion des polaren Flagellensystems nicht beeinflusst. Dies wird deutlich, da eine Deletion von motL lediglich in dem Stamm deltaflagP, der nur noch laterale Flagellen ausbildet, zu einer Steigerung der Ausbreitungseffizienz auf Weichagarplatten führte, während die Deletion von motL die Ausbreitungseffizienz im Wildtyp und dem Stamm deltaflagL, der nur noch polare Flagellen ausbildet, nicht beeinflusste. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass MotL mittels des konservierten Aminosäuremotivs RxxR_DxSxxG c-di-GMP bindet und dadurch von einer inaktiven Form in eine aktive Form übergeht. MotLAAx, eine c-di-GMP-insensitive Variante von MotL, zeigte auch nach einer Überproduktion keinen negativen Effekt auf die Ausbreitungseffizienz auf Weichagarplatten. Die Überproduktion von MotL in seiner nativen Form hingegen führte zu einer stark verringerten Ausbreitungseffizienz auf Weichagarplatten und auch zu einer deutlich herabgesetzen Schwimmgeschwindigkeit in Flüssigmedium. Dieser Effekt wurde durch die gleichzeitige Überproduktion von MotL und einer Diguanylatzyklase (DgcA) beziehungsweise einer Phosphodiesterase (PdeH) noch deutlicher. Bei einem artifiziell erhöhten intrazellulären c-di-GMP-Spiegel, also bei einer Überproduktion von DgcA, resultierte die Überproduktion von MotL in einer noch stärkeren Reduktion der Ausbreitungseffizienz und der Schwimmgeschwindigkeit im Vergleich zur alleinigen Überproduktion von MotL. Umgekeht führte die Überproduktion von MotL bei einem artifiziell erniedrigten c-di-GMP-Spiegel, durch gleichzeitige Überproduktion von PdeH, zum Verlust des negativen Effekts, da es hier zu einer Erhöhung des Ausbreitungsradius und der Schwimmgeschwindigkeit im Vergleich zur Überproduktion von MotL alleine kam. In dieser Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sowohl MotL als auch MotLAAx in der Zelle an einer lateralen oder subpolaren Position lokalisieren und mit dem lateralen Rotorprotein FliM2 und dem Statorprotein MotB kolokalisieren. Weitere Interaktionsstudien zeigten für MotL und MotLAAx auch eine Interaktion mit diesen und weiteren Proteinen des lateralen Flagellenmotors. Somit stellt MotL in S. putrefaciens CN-32 eine c-di-GMP-abhängige sterische Bremse mit einer Spezifität für das laterale Flagellensystem dar.