Detektion von geringfrequenten Varianten in B-Zell-Lymphomen zur genomischen Charakterisierung pädiatrischer Hodgkin-Lymphome mit primär erhöhter Chemotherapieresistenz

Abstract

Pädiatrische Hodgkin-Lymphome (pHL) sind gut therapierbare maligne Tumore des lymphatischen Systems, deren 5-Jahre overall survival (OS) und event free survival (EFS) bei 97,4% und 89% liegt. 5% dieser Patienten zeigen eine primär reduzierte Chemotherapie-Sensitivität, erkennbar an einem qPET > 3 nach 2 Zyklen Induktions-OEPA-Chemotherapie und deren 2-Jahres EFS liegt bei 50%. Wegen des geringen Anteils an Hodgkin-Reed-Sternberg (HRS)-Zellen (ca. 1-5%) in den befallenen Lymphknoten ist die Untersuchung von HL, aufgrund der zuvor notwendigen Mikrodissektion der HRS-Zellen, außerordentlich schwierig, weshalb bislang nur wenige genomische Aberrationen bekannt sind und eine geringe Anzahl an Patienten untersucht wurde. Die Pathogenese aller pHL und die Unterschiede der chemotherapiesensitiven (qPET < 3) und primär chemotherapieresistenten Gruppe (qPET > 3) sind daher weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit sollte deshalb zunächst eine valide Methode zur Identifikation geringfrequenter Varianten mittels targeted Next Generation Sequencing (tNGS) ohne vorherige Mikrodissektion der HRS-Zellen etabliert werden.Hierfür kamen zwei tNGS-Panels zur Anwendung, die Abschnitte oder die vollständigen Bereiche von Genen abdeckten, die in HL und Non-HL häufig von single nucleotide variants (SNVs) und Indels betroffen sind. Es konnte durch die Untersuchung von insgesamt 22 pHL gezeigt werden, dass sich die hybrid-capture-basierte Methode unter Verwendung von circulating cell free DNA (ccfDNA), im Gegensatz zum Amplikon-basierten dual-strand-Verfahren mit genomischer DNA (gDNA), für die Detektion von niederfrequenten Varianten am besten eignet. Im Vergleich zwischen gDNA und ccfDNA konnte mit dem hybrid-capture-basierten Verfahren durch Untersuchungen an 11 pHL-Patienten gezeigt werden, dass ccfDNA für die niederfrequente Variantendetektion bei pHL geeigneter ist, als gDNA aus FFPE-Gewebe.Es wurde bei der Untersuchung von pHL-Patienten unter Verwendung von ccfDNA deutlich, dass der JAK/STAT-Signalweg mit Varianten in 64% der untersuchten Patienten, der am häufigsten betroffene Signalweg war, gefolgt vom PI3K/AKT-Signalweg mit Varianten in 41% der Patienten und dem NFkappaB-Signalweg mit Varianten in 36% der Patienten. In 22,7% der pHL-Patienten konnten Varianten detektiert werden, die mit Chromatin-modifizierenden Proteinen assoziiert sind. Zudem konnten in 64% der untersuchten Patienten Varianten identifiziert werden, die eine Immunevasion der HRS-Zelle begünstigen könnten, indem sie die Neo-Antigen (AG)-Präsentation verhindern. Insgesamt konnten sowohl bereits bekannte, sowie neue mutierte Gene identifiziert werden, die in HL derzeit unbekannt sind. Zudem konnte durch Untersuchungen an ccfDNAs durch Identifikation von klonalen VDJ/DJ-Rekombinationen in 32% der Patienten durch Mutationsanalysen gezeigt werden, dass auch die HRS-Zellen der pHLs von prä-apoptotischen germinal center (GC)-B-Zellen abstammen. Es wurde außerdem eine Translokation (IgH-Switch-Region gamma 2/AICDA) in einem pHL-Patienten identifiziert, die in HL bislang unbekannt war.Durch den Vergleich der Varianten-Allelfrequenz (VAF) der identifizierten Varianten, die in ccfDNAs, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Behandlung (vor, während und nach der Therapie) von 6 qPET > 3 und 10 qPET < 3 pHL-Patienten entnommen wurden, detektiert wurden, konnte zudem gezeigt werden, dass ccfDNA von pHL-Patienten durch ersichtliche Unterschiede zwischen den qPET < 3 und > 3-Patienten für das Therapiemonitoring geeignet ist und ein geeigneter Ansatz zu sein scheint, um das Ansprechen der Therapie bereits zu einem frühen Zeitpunkt überwachen zu können.Bei dem Vergleich der 9 chemotherapieresistenten- (qPET > 3) mit den 13 chemotherapiesensiblen Patienten (qPET < 3) fiel auf, dass der Anteil an Varianten je Patient bei den qPET > 3-Patienten erhöht war. Zudem konnte beobachtet werden, dass Varianten in Genen, die mit der AG-Präsentation assoziiert sind, bei den qPET > 3-Patienten mit 55%, im Gegensatz zu den qPET < 3-Patienten mit 23%, stark repräsentiert wurden.Außerdem konnte in dieser Arbeit durch eine Machbarkeitsstudie mit 11 pHL-Patienten zum ersten Mal gezeigt werden, dass sich ccfDNA von pHL für Ganz-Exom-Analysen eignet und die exomweite Detektion niederfrequenter Varianten ermöglicht.Zudem konnte bei der histologischen Untersuchung von 4 qPET > 3 und 5 qPET < 3-Patienten beobachtet werden, dass der Anteil an Pikrosiriusrot (PSR) positiven Zellen in den qPET > 3-Patienten signifikant erhöht war und dass tendenziell mehr kollagenummantelte HRS-Zellen in den qPET > 3-Patienten vorlagen, als in den qPET < 3-Patienten. Somit könnte die Feststellung bei Bauchspeicheldrüsen- und Brustkrebs-Patientinnen, dass eine erhöhte Expression von Kollagen zu einer Chemotherapieresistenz führt, auch bei den qPET > 3-Patienten der pHL einer der Gründe sein, die zu einer erniedrigten Chemotherapie-Sensitivität führt. Pediatric Hodgkin´s lymphomas (pHL) are well-treatable malignant tumors of the lymphatic system, whose 5-years overall survival (OS) and event free survival (EFS) are 97.4% and 89%, respectively. 5% of these patients show a primary reduced chemotherapy sensitivity, indicated by a qPET > 3 after 2 cycles of induction OEPA chemotherapy, and a 2-year EFS of 50%. Due to the low proportion of Hodgkin-Reed-Sternberg (HRS) cells (approx. 1-5%) in the affected lymph nodes, the examination of HL is extremely difficult due to the previously necessary microdissection of the HRS cells which is why only few genomic aberrations are known so far and a small number of patients have been examined. The pathogenesis of all pHL, and the differences between the chemotherapy-sensitive (qPET < 3), and the primary chemotherapy-resistant group (qPET > 3) are therefore mostly unknown. In this study a valid method for the identification of low-frequency variants using targeted Next Generation Sequencing (tNGS) without prior microdissection of the HRS cells should be established.For this purpose two tNGS panels were used, covering sections or complete areas of genes frequently affected by single nucleotide variants (SNVs), and Indels in HL and Non-HL. The investigation of a total of 22 pHL showed that the hybrid-capture-based method using circulating cell free DNA (ccfDNA), contrary to the amplicon-based dual-strand method using gDNA is best suited for the detection of low-frequency variants. In a comparison of gDNA and ccfDNA, the hybrid-capture-based method was able to show that ccfDNA is more suitable for low-frequency variant detection than genomic DNA (gDNA) from FFPE tissue in 11 pHL patients.Studying pHL patients with ccfDNA revealed that the JAK/STAT signaling pathway with variants in 64% of patients was the most frequently affected signaling pathway, followed by the PI3K/AKT signaling pathway with variants in 41% of patients, and the NFkappaB signaling pathway with variants in 36% of patients. Variants associated with chromatin-modifying proteins were detected in 22.7% of pHL patients. Variants could also be identified that might promote immune evasion of the HRS cell by preventing neo-antigen (AG) presentation in 64% of the pHL patients. In total, both already known and new mutant genes could be identified that are currently unknown in HL. In addition, studies on ccfDNA by identification of clonal VDJ/DJ recombination showed by mutation analysis that the HRS cells of the pHLs also originate from pre-apoptotic germinal center (GC)-B cells in 32% of the patients. Furthermore, a translocation (IgH switch region gamma 2/AICDA) was identified in a pHL patient that was previously unknown in HL.By comparing the variant allel frequency (VAF) of the identified variants detected in ccfDNA taken at different times of treatment (before, during and after therapy) from 6 qPET > 3 and 10 qPET < 3 pHL patients, it could be shown that ccfDNA from pHL patients is suitable for therapy monitoring due to obvious differences between the qPET < 3 and > 3 patients, and appears to be a suitable approach for monitoring the response of therapy at an early stage.When comparing the 9 chemotherapy-resistant patients (qPET > 3) with the 13 chemotherapy-sensitive patients (qPET < 3), it was noticed that the proportion of variants per patient was increased in the qPET > 3 patients. In addition, it was observed that variants in genes associated with the AG presentation were strongly represented in the qPET > 3 patients with 55%, in contrast to the qPET < 3 patients with 23%.Furthermore, in a feasibility study with 11 pHL patients it was shown for the first time that ccfDNA of pHL is suitable for whole exom analyses and enables the exom-wide detection of low frequency variants.In addition, the histological examination of 4 qPET > 3 and 5 qPET < 3 patients showed that the proportion of Sirius red (PSR) positive cells in the qPET > 3 patients was significantly increased and that more collagen-coated HRS cells tended to be present in the qPET > 3 patients than in the qPET < 3 patients. Thus, the finding in pancreatic and breast cancer patients that increased expression of collagen leads to chemotherapy resistance may also be one of the reasons for reduced chemotherapy sensitivity in qPET > 3 patients with pHL.