Aufklärung der Regulation und Funktion des Toll-like Rezeptor 9 Signalweges in Adipozyten und seine Bedeutung im Kontext von Adipositas

Abstract

Weltweit sterben jährlich mindestens 2,8 Millionen Menschen pro Jahr an den Folgen von Adipositas. Übergewicht und Adipositas sind mit zahlreichen Komorbiditäten wie Diabetes mellitus Typ 2, Krebs und kardiovaskulären Erkrankungen assoziiert und bedeuten massive Einschränkungen der Lebensqualität der Betroffenen. Neben der Volumenzunahme des Fettgewebes kommt es bei Adipositas auch zu einer proinflammatorischen Transformation (adipose inflammation). Diese Adipositas-assoziierte metabolische Entzündung wird auch als Metaflammation bezeichnet. Lange Zeit wurde das Fettgewebe als simpler Energiespeicher verstanden, da die primäre Funktion von Fettzellen die Umwandlung von Glukose zu Fettsäuren ist, die sie in Form von Triglyzeriden in ihren Lipidvakuolen für einen späteren Bedarf speichern. In den letzten Jahrzehnten hat sich das Fettgewebe, vor allem durch seine Fähigkeit zur Sekretion von Adipokinen, als endokrines Organ etabliert. Durch die aktive Expression diverser bioaktiver Peptide ist es in der Lage, zahlreiche physiologische Prozesse zu beeinflussen. Aktuelle Studien konnten außerdem nachweisen, dass Adipozyten selbst in der Lage sind immunmodulatorisch zu wirken, indem sie über die Expression und Aktivierung von TLRs aktiv die Sekretion antipathogener Moleküle induzieren. Neuste Erkenntnisse implizieren, dass die Aktivierung von TLRs in diversen Geweben zur Entstehung der Adipositas-assoziierten Insulin-Resistenz beitragen könnten. Dabei scheint vor allem die Expression von TLR9 bei Adipositas von großer Bedeutung zu sein. Sämtliche Studien zu TLR9 fokussieren sich allerdings auf dessen Expression und Funktion in Immunzellen wie Makrophagen oder dendritische Zellen. Zu TLR9 in Adipozyten ist bislang wenig bekannt.Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals die Gen- sowie Proteinexpression von TLR9 in murinen 3T3-L1 Adipozyten, sowie in humanen und murinen Fettgeweben nachgewiesen werden. Analysen von 3T3-L1 Adipozyten zu verschiedenen Zeitpunkten der adipozytären Differenzierung ergaben dabei, dass TLR9 im Verlauf der Adipogenese induziert wird. Immunzytochemische Analysen wiesen außerdem auf eine zytoplasmatische Lokalisation von TLR9 in Adipozyten hin. Die TLR9 Expression ist im viszeralen gegenüber dem sc Fettgewebe von nicht-diabetischen Adipositaspatientinnen signifikant erhöht und korreliert Fettdepot-abhängig mit systemischen Resistinkonzentrationen.Ein siRNA-vermittelter Knockdown von TLR9 in 3T3-L1 Adipozyten konnte außerdem nachweisen, dass eine intakte TLR9-Expression notwendig für eine adäquate adipozytäre Differenzierung ist. Der TLR9 Knockdown verursachte eine Inhibition der intrazellulären Lipidakkumulation, sowie der Expression des Adipozyten spezifischen Adipokins Adiponektin. Korrelierend mit diesen Beobachtungen wurde auch im Serum von TLR9-defizienten BALB/c Mäusen verglichen mit Wildtyp Mäusen eine signifikant reduzierte Adiponektinkonzentration detektiert.Um außerdem die regulatorische Funktion von TLR9 in Adipozyten zu analysieren, wurden zusätzlich Stimulationsexperimente mit synthetischen CpG-ODNs durchgeführt. Während eine Stimulation von murinen 3T3-L1 Adipozyten mit diesen TLR9-Liganden die Expression und Sekretion des proinflammatorischen Proteins Resistin reduziert, blieb die Sekretion des eher antiinflammatorischen Adiponektins unverändert. Diese Effekte blieben größtenteils auch bei einer Kostimulation mit dem proinflammatorischen Molekül LPS bestehen. Genexpressionsanalysen nach Stimulation mit CpG-ODNs ergaben außerdem, dass auch die Expression von proinflammatorischen MCP-1 durch die Aktivierung der TLR9-Signalkaskade inhibiert wird. Zusätzlich wurde ein Einfluss der TLR9-spezifischen Ligandenbindung auf die Expression der Glukosetransporter detektiert. Um zu verifizieren, dass diese Effekte in Abhängigkeit von TLR9 induziert werden, wurden außerdem analoge Stimulationsexperimente mit TLR9-Liganden in primären Adipozyten aus Wildtyp- und TLR9-defizienten Mäusen ex vivo durchgeführt. Dabei haben die verschiedenen CpG-ODNs unterschiedliche Effekte in den primären Adipozyten aus TLR9-/- und TLR9wt/wt Mäusen ausgelöst. In primären humanen Adipozyten hat die Stimulation mit den verschiedenen TLR9 Liganden eine starke Inhibition der MCP-1 Expression ausgelöst, während die Adiponektinexpression überwiegend unbeeinflusst blieb.Zusammenfassend scheint TLR9 in Adipozyten damit, anders als in Immunzellen, eine eher antiinflammatorische Funktion zu haben. Möglicherweise erkennen Adipozyten die Nukleotide, welche von nekrotischen Adipozyten (crown-like structures) bei viszeraler Adipositas lokal freigesetzt werden. Eine gezielte Beeinflussung der adipozytären TLR9 Signaltransduktion bietet damit einen potentiellen neuen, protektiven Therapieansatz für die proinflammatorische Transformation des Fettgewebes, vor allem bei Adipositas. Worldwide approximately 2.8 million deaths per year are related to obesity and its numerous comorbidities, e. g. diabetes mellitus type 2, cancer and cardio-vascular disease. Furthermore obesity not only portrays a severe burden for public health systems, but it also implies a substantial restriction in the quality of life for obese patients. There are numerous key elements causing an excess of nutrients and energy, inducing a general increase of total adipose tissue mass. In response multiple cell types including immune cells generate a systemic low-grade inflammatory state of the adipose tissue (adipose inflammation). This metabolic inflammatory state is also known as metaflammation. Traditionally, adipose tissue was seen as a simple reservoir for energy storage, due to its primary function of metabolizing glucose into fatty acids and to store them in form of triglycerides within the lipid droplets of adiocytes. Within the last decades this understanding has changed. Today adipose tissue is known to be an endocrine organ, which directly influences numerous physiological processes through the active secretion of cytokines and chemokines. Furthermore recent studies demonstrated that adipocytes themselves are able to actively participate in anti-microbial responses by the activation and expression of different pattern recognition receptor (PRR) subtypes, such as Toll-like receptors (TLRs). Recent data imply an association between the activation of TLRs and insulin resistance within obesity, particularly the expression of TLR9. Currently, available studies on the role of TLR9 during obesity exclusively focused on its expression and function in immune cells, like macrophages and dendritic cells. To date little is known about TLR9 in adipocytes. Within this work the TLR9 gene and protein expression were described for the first time in murine 3T3-L1 adipocytes, as well as in human and murine adipose tissue. Analysis of 3T3-L1 adipocytes on different states of adipose differentiation revealed, that TLR9 expression is induced during adipogenesis. Immunocytochemical analysis implied a cytoplasmatic localization of TLR9. Total TLR9 gene expression in visceral adipose tissue was significantly induced compared to subcutaneous adipose tissue in female non-diabetic patients suffering from obesity. Depending on different fat depots there was a significant correlation of the TLR9 gene expression and systemic resistin concentrations.In 3T3-L1 adipocytes a siRNA-mediated knockdown of TLR9 revealed that TLR9 expression is inevitable for functional adipogenesis. TLR9 knockdown caused a severe inhibition of intracellular lipid accumulation and significantly reduced adiponectin expression. In correlation to these findings systemic adiponectin levels are significantly reduced in TLR9-deficient BALB/c mice compared to wildtype littermates. The physiological function of TLR9 in adipocytes was analyzed by stimulation experiments using synthetic TLR9 agonists, so called CpG-oligonucleotides (ODNs), containing a cytosine phosphate guanine (CpG) dideoxynucleotide motif. Agonist activation of TLR9 in murine 3T3-L1 adipocytes significantly reduced the secretion of proinflammatory resisitin, while concentrations of antiinflammatory adiponectin remained unaffected. In general co-stimulation with proinflammatory lipopolysaccharide (LPS) did not alter the stimulatory characteristics of CpG-ODNs on the adipokine secretion profile. Gene-expression analysis following stimulation with CpG ODNs revealed a significant reduction of proinflammatory monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1). Interestingly activation of TLR9 signalling also had an impact on gene-expression of glucose transporters. To verify that these stimulatory effects were TLR9-dependent, analogous experiments were performed using ex vivo differentiated primary adipocytes from TLR9wt/wt and TLR9-/- mice. Stimulation with TLR9-agonists had differential effects on gene-and protein-expression. In primary human adipocytes MCP-1 expression was significantly reduced upon CpG-ODN stimulation, while adiponectin expression remained unaffected.Thus, opposed to its well described function in immune cells, adipocytic TLR9 seems to have a rather antiinflammatory effect. Thus, adipocytes are potential physiological sensors of nucleotides, released by necrotic adipocytes (crown-like structures) within visceral obesity. Therefore the specific manipulation of adipocytic TLR9-signalling could be a potential target for a new protective therapy against adipose tissue inflammation, especially within obesity.