Die Rolle von Titin in der Sarkomerogenese : Untersuchungen an adulten Kardiomyozyten der Ratte in Langzeitkultur

Abstract

Die Rolle von Titin als 'molekulare Matrize' in der Sarkomerogenese wird in der Literatur oft diskutiert. In der vorliegenden Studie, wurdedie Hypothese untersucht, daß die Expression von Titin Voraussetzung für die Inkorporation der dicken Filamente in die Sarkomeren ist.Diese Untersuchung wurde mit Hilfe von Antisense-Oligodesoxynukleotiden, die die Translation von Titin beeinflussen, amRedifferenzierungsmodell adulter Kardiomyozyten der Ratte (ARC) in Langzeitkultur duchgeführt. Vor der Durchführung der eigentlichen Antisense-Oligodesoxynukleotid-Experimente wurden das Wachstumsmuster und die Größe derZelloberfläche der unterschiedlichen Phänotypen der ARC in Langzeitkultur bestimmt und standardisiert. Dies stellt die Grundlage für dieAntisense-Oligodesoxynukleotid-Experimente dar, die mittels drei für Titin-mRNA-spezifischen Antisense PhosphorothioatOligodesoxynukleotiden (Antisense S-ODN) in einer Konzentration von 10 [my]mol durchgeführt wurden. In Vorversuchen mit Hilfe von Fluorescein-markierten S-ODN konnte die Aufnahme in die ARC im Konfokalen Lasermikroskopnachgewiesen werden. Desweiteren war sowohl bei Antisense als auch bei Random S-ODN eine signifikante Zunahme der Zellgröße imVergleich zu unbehandelten Kontrollzellen zu verzeichnen. Die Antisense S-ODN-Behandlung verursachte am 12. und 16. Tag in Kultur eine deutlich reduzierte Expression von Titin und eine Störungder Myosininkorporation in die Sarkomeren. Diese Störung war überwiegend durch eine diffuse Myosinmarkierung und durch einesignifikante Abnahme der regelmäßigen Myosinquerstreifung im Verhältnis zur gesamten Zellfläche (Tag 12 und 16: Kontrolle 75%, Tag 12:S-ODN I und II 20%, Tag 16: S-ODN I und II 14%) gekennzeichnet. Die zelluläre Integrität, definiert durch das Vorhandensein des typischen[alpha]-Aktinin-Musters und der Streßfaser-artigen Strukturen, war nicht gestört. Diese Ergebnisse liefern entscheidende Hinweise für die Richtigkeit der Hypothese, daß Titin ein Rolle als 'molekulare Matrize' spielt,indem es die Inkorporation der Myosinfilamente in die Sarkomeren koordiniert. Die Anwesenheit von Titin ist somit eine Voraussetzung fürdie Sarkomerogenese. An essential role of titin as a 'molecular ruler' in sarcomerogenesis has been frequently discussed. In this study, we tested the hypothesisthat the expression of titin is a prerequisite for thick filament incorporation into sarcomeres by utilizing an antisense oligodeoxynucleotideapproach to interfere with titin translation in the redifferentiation model of adult rat cardiomyocytes (ARC) in long-term culture. As a first step, the growth pattern ranging from rod shaped to round and later to spreading cells and the cell surface area of ARC werequantitatively evaluated and standardized. This represents the basis for experiments interfering with sarcomere formation using threedifferent antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides (S-ODN) at a dosage of 10 [my]M specific for titin mRNA. The presence of fluorescein-labeled S-ODN in ARC indicated cellular uptake of antisense and random S-ODN, and both induced asignificant increase in cell size as compared with untreated ARC serving as control. At days 12 and 16 in culture, antisense S-ODN treatment resulted in reduced expression of titin and a disturbance of myosin incorporationinto sarcomeres, which is evident by diffuse myosin labeling in the majority of cells and a significantly decreased area of regular myosincross-striation (day 12 and 16: control 75%, day 12: S-ODN I and II 20%, day 16: S-ODN I and II 14%) as observed by laser scanningconfocal microscopy. Cellular integrity indicated by the presence of [alpha]-actinin and F-actin was not disturbed. These findings provide evidence for the role of titin as a molecular template for myosin incorporation and therefore titin is a prerequisite forsarcomerogenesis.