Untersuchungen zum Vorkommen von Wachstumsfaktoren (aFGF, bFGF, TGF-[alpha]) und deren Rezeptoren (FGF-R, EGF-R) in der Plazenta des Rindes

Abstract

Ziel dieser Untersuchung war es, die Expression und Verteilung der Wachstumsfaktoren aFGF, bFGF, TGF-[alpha] und ihrer RezeptorenFGF-Rezeptor und EGF-Rezeptor in Plazentomen von Rindern in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Gravidität sowie der Geburt zu erfassen.Plazentome wurden von jeweils drei 150, 220, 240 und 270 Tage tragenden Kühen, sowie von drei Geburtstieren, bei denen eine Sectiocaesarea durchgeführt worden war, gewonnen, formalinfixiert und paraffineingebettet. Die eingesetzten immunhistochemischen Nachweisverfahren unter Verwendung von biotinylierten Sekundärantikörpern und derABC-Methode erwiesen sich bei Auswahl geeigneter Reagenzien und Versuchsprotokolle zum Nachweis von aFGF, bFGF, FGF-Rezeptorund EGF-Rezeptor als geeignet. Dabei mußten, um unspezifische Färbereaktionen eindeutig von spezifischen Reaktionen abgrenzen zukönnen, bei jedem Versuch geeignete Positiv- bzw. Negativkontrollen (Isotypenkontrollen der Antikörper, Einsatz von definierten Positiv-bzw. Negativkontrollen) herangezogen werden. Um weiterhin Einflüsse auf den Ablauf der immunhistochemischen Nachweisreaktion undderen Bewertung so gering wie möglich zu halten, wurden alle Versuche unter gleichen Rahmenbedingungen von einer Persondurchgeführt. Ein geeignetes Versuchsprotokoll zum spezifischen Nachweis von TGF-[alpha] konnte nicht entwickelt werden. Der Wachstumsfaktor aFGF konnte unabhängig vom Trächtigkeitsstadium bei weitgehend einheitlichem Färbemuster in allen untersuchtenPräparaten in allen Zellpopulationen nachgewiesen werden. Die Funktion von aFGF im Plazentom wird daher weniger im Hinblick aufseine mitogenen Wirkungen, sondern eher im Zusammenhang mit seinen nicht-mitogenen Wirkungen (zelluläre Differenzierung,Beeinflussung des zellulären Stoffwechsels und der Zellmigration) gesehen. Auch der Wachstumsfaktor bFGF konnte mit Hilfe von zwei verschiedenen Antikörpern in den untersuchten Plazentomen zweifelsfreinachgewiesen werden, wobei sich die Reaktionsmuster der eingesetzten Antikörper hauptsächlich durch ihre Reaktionen in denepithelialen Anteilen unterschieden. Während bei beiden Antikörpern die Stromaanteile in allen untersuchten Stadien schwache bisintensive nukleäre Signale zeigten, reagierte der monoklonale Antikörper in den epithelialen Anteilen überwiegend zytosolisch, derpolyklonale Antikörper zeigte dagegen neben schwachen zytosolischen Signalen auch schwache bis intensive nukleäre Reaktionen.Auffallend ist die Reduktion der Immunreaktion am Tag 220, die bei beiden Antikörpern zu beobachten war. Die Reaktionen des Stromaswerden im direktem Zusammenhang mit proliferativen Prozessen und der Förderung der Angiogenese gesehen, während die epithelialenReaktionen mehr als Ausdruck nicht-mitogener Wirkungen (Differenzierung, Modulation der Proteinbiosynthese und -sekretion) des bFGFinterpretiert werden. Die unterschiedlichen Reaktionen der eingesetzten Antikörper können durch das Erkennen unterschiedlicherbFGF-Isoformen erklärt werden. Auch die Expression eines Wachstumsfaktor-Rezeptors FGF-R in den Rinderplazentomen konnte in der vorliegenden Studie gezeigtwerden, wobei die Signalintensität und Signalausbreitung in Abhängigkeit vom Trächtigkeitsstadium variierten. Das maternale Stromazeigte ein schwaches bis intensives Signal der äußeren Zellmembran bzw. des Zytosols der Stromazellen, wobei an den Tagen 220, 240und unter der Geburt die Anzahl der betroffenen Zellen höher war als an den Tagen 150 und 270. Alle untersuchten Stadien zeigten imfetalen Stroma ein nukleäres und perinukleäres Signal, welches am Tag 150 sehr schwach bis schwach war, mit zunehmender Trächtigkeitstärker wurde und ab Tag 240 bis zur Geburt schwach bis deutlich ausgeprägt war. Das Karunkelepithel wies ein schwaches zytosolischesund überlappend schwaches nukleäres Signal auf, welches an Tag 240 in vielen Zellen und an Tag 270 nur noch in einigen Zellennachweisbar war, wobei in den Präparaten auch vollständig negative Regionen auffielen. Die beiden Zelltypen des Trophoblasten (BNCund Uninukleäre) reagierten einheitlich mit einem parazellulären und membranständigen bzw. zytosolischen Signal, welches an den Tagen150, 220, 270 in vielen Zellen, an Tag 240 und unter der Geburt in nahezu allen Zellen auftrat. An Tag 220 fiel zusätzlich ein schwachesnukleäres Signal einzelner Zellen auf, hier waren die Signale besonders in der Nähe großer Stromastraßen zu finden. Eine Differenzierungzwischen FGF-Rezeptor 1 und FGF-Rezeptor 2 war allerdings nicht möglich. Ebenso konnte die Expression des Wachstumsfaktor-Rezeptors EGF-R nachgewiesen werden, wobei das immunhistologische Signalweitestgehend auf die epithelialen Plazentomanteile beschränkt war. Die Signalintensität und -ausbreitung variierte dabei nicht nur inAbhängigkeit vom Trächtigkeitsstadium, sondern zeigte auch große Schwankungen zwischen den Tieren des gleichen Stadiums. Letzterespiegeln möglicherweise unterschiedliche Ligandkonzentrationen in den jeweiligen Präparaten wider. Der Verlust des Signals unter derGeburt erklärt sich aus der fortschreitenden Degeneration des maternalen Karunkelepithels; der Verlust der Signalintensität am Tag 220entspricht den Beobachtungen bei bFGF. Zusammenfassend ergibt sich, daß die Wachstumsfaktoren aFGF und bFGF sowie die Wachstumsfaktor-Rezeptoren FGF-R und EGF-Rin der zweiten Hälfte der Gravidität und/oder unter der Geburt in den Plazentomen von Rindern exprimiert werden. Damit kann dieBedeutung dieser Faktoren für die Entwicklung und Funktion der Rinderplazenta als belegt angesehen werden. This study examines the expression and the distribution of the growth factors aFGF, bFGF and TGF-[alpha] and their receptors FGF-R andEGF-R during the second half of pregnancy and throughout parturition. Placentomes were collected from cows at days 150, 220, 240 and270 of pregnancy and from normal-term placentas, these latter extracted by caesarean section. Each group consisted of three animals.After removal placentomes were fixed in formalin and embedded in paraffin. As long as the right reagents and pre-treatments of the probes were chosen, the immunohistochemical technique using biotinylatedsecondary antibodies and the ABC-complex was the appropriate one for detecting aFGF, bFGF, FGF-R and EGF-R, although controlswere essential in order to distinguish between specific and non-specific immunolabelling (isotypic control of antibodies, knownpositive/negative tissues). To reduce extraneous influences on the immunolabelling, all tests were prepared by myself under the sameconditions. In this investigation specific detection of TGF-[alpha] was not possible. Immunolabelling of aFGF did not depend on the stage of pregnancy, but resulted in nearly the same staining pattern in each probe anddetected the growth factor in each cell type. It seems that in bovine placentomes aFGF does not act as a mitogen, but activatesnon-mitogenic cell functions (cellular differentiation, modulation of cellular metabolism, and cellular motility and migration). The growth factor bFGF was detected in bovine placentomes by two different antibodies, which gave different staining patterns. While themonoclonal antibody showed cytoplasmic immunostaining of epithelial cells, the polyclonal antibody located weak to intenseimmunostaining of the nuclei, concurrent with weak cytoplasmic reaction in these cells. Additionally, both antibodies were immunoreactivein nuclei of stromal cells and showed a reduction of immunoreactivity at day 220. Stromal reactions of bovine placentomes indicate thatbFGF stimulates cell proliferation and angiogenesis, while epithelial reactions are connected with non-mitogenic cell functions (changes indifferentiated cell function, modulation of specific cellular protein synthesis). The different staining patterns could be due to the recognitionof different isoforms of bFGF. The present study detected the expression of FGF-R in bovine placentomes during the second half of pregnancy to parturition and provedthat the staining pattern varied according to the different stages of pregnancy. Outer membranes and cytoplasm of the maternal stromalcells stained with a weak to intensive signal, while on days 220, 240 and at parturition the number of positive cells was higher than on days150 and 270. At each investigated stage of pregnancy foetal stromal cells had nuclear and perinuclear immunostaining, which started withextra-weak to weak reaction on day 150, became stronger as pregnancy progressed and ended with weak to strong reactions from day240 to parturition. Cytoplasmic signals of the caruncular epithelium cells were weak and overlapped with weak reaction of the nuclei; on day240 many cells reacted positive while on day 270 only a few cells stained. Remarkably, some parts of the probes were absolutely negative.The two trophoblastic cell types (BNC and columnar trophoblastic cells) reacted in the same way to positive cell membranes or cytoplasm;on days 150, 220 and 270 many cells stained, while on day 240 and at parturition almost all cells were positive. Additionally, there was aweak nuclear signal of single cells on day 220. This latter signal was most commonly found beside greater stromal areas. There is nopossibility of differentiation between FGF-R 1 and FGF-R 2. EGF-R expression was also detected, whereas the staining reaction was restricted to the epithelial parts of placentomes. Intensity anddistribution of the signals did not vary only according to the stage of pregnancy but also between different animals at the same stage ofpregnancy. This probably reflects the different concentrations of EGF-R/ligand in the individual specimen. The loss of signals in at-termplacentomes can be explained by the progressive degeneration of the caruncular epithelium, while loss of signals on day 220 correspondsto the observations at bFGF. In conclusion, during the second half of gestation and under parturition the growth factors aFGF and bFGF, as well as their receptorsFGF-R and EGF-R, are expressed in bovine placentomes. Therefore, these proteins are important for the development and function ofbovine placentomes.