Einfluß fünf verschiedener nicht-genotoxischer Karzinogene auf das Wachstum spontan entstandener präneoplastischer Herde in der Leber alter Wistar Ratten

Abstract

Der Einfluß fünf verschiedener nicht-genotoxischer Karzinogene auf das Wachstum spontan entstandener präneoplastischer Herde (FAH= 'foci of altered hepatocytes') in der Leber ca. 2 Jahre alter Wistar Ratten wurde untersucht. Die verwendeten nicht-genotoxischenKarzinogene stellen bekannte, über verschiedene Mechanismen wirkende Lebertumor-Promotoren dar: Phenobarbital, Chloroform,Wyeth-14,643, Ethinylestradiol und PCB 126. Die Lebertumor-Promotoren wurden in karzinogener Dosis über 1, 4 und 13 Wochenverabreicht. Daneben wurde die Auswirkung der Substanzapplikation auf die extrafokale Proliferation analysiert. Als Meßparameter für die Quantifizierung des Wachstums der FAH dienten die Anzahl pro cm2 Leberfläche, die durchschnittliche Größe(Zellzahl/FAH-Querschnitt), die Zellproliferationsrate (Labelling-Index) und der Apoptose-Index unter Berücksichtigung der verschiedenenFAH-Typen. Die Messung der extrafokalen Proliferation wurde nach der LZM ('lobule dependent zonal measurement')-Methode(BAHNEMANN und MELLERT, 1997) durchgeführt. Die Identifizierung und Klassifizierung der FAH erfolgte anhand morphologischer Kriterien in der HE-Färbung in Kombination mit demimmunhistologischen Nachweis der GST-P-Expression. Der Labelling-Index wurde durch immunhistochemischen Nachweis von in die DNAder Leberzellkerne eingebauten BrdU ermittelt. BrdU wurde über eine subkutane Minipumpe 7 Tage lang appliziert. Der Apoptose-Indexwurde durch Zählung der apoptotischen Körperchen in der HE-Färbung bestimmt. Die Prävalenz von FAH lag in allen Gruppen bei 100 %. Bei den drei Kontrollgruppen waren 84 % bis 89 % der gefundenen FAH CCF.Der Anteil an BCF und NAH betrug 4 % bis 8 %. Eine statistisch gesicherte Promotionswirkung der Substanzen in Form einer Steigerung der Gesamt-FAH-Anzahl/cm2 wurde nur fürEthinylestradiol deutlich. Bei differenzierter Betrachtung der verschiedenen FAH-Typen äußerten sich die promovierenden Eigenschaften inder Erhöhung der Anzahl bestimmter FAH-Typen pro cm2 Leberfläche (Phenobarbital und PCB 126: ECF, Wyeth-14,643: BCF,Ethinylestradiol: BCF und MCF). Damit wurden in alten Ratten durch Phenobarbital, Wyeth-14,643 und PCB 126 die auch inInitiations-Promotions-Protokollen beschriebenen FAH-Typen promoviert. Den deutlichsten Hinweis auf die Promotionswirkung der Substanzen erbrachte im Vergleich zu den anderen Parametern die Steigerungdes LI innerhalb der FAH. Alle Substanzen bis auf PCB 126 verursachten einen initialen transienten Anstieg des LI in CCF (Wyeth-14,643:7,8-fach, Ethinylestradiol: 4,6-fach, Chloroform: 3-fach, Phenobarbital: 1,9-fach) mit nachfolgendem Abfall. Unter der Chloroform-,Wyeth-14,643- und Ethinylestradiol-Behandlung konnte eine dauerhafte Steigerung des LI in CCF ermittelt werden. BCF wiesen alsFAH-Typ mit einem höheren Potential zur malignen Transformation nach der einwöchigen Verabreichung der Substanzen (bis aufPhenobarbital) einen höheren LI auf als CCF. Der LI innerhalb von FAH (mit Ausnahme von NAH) lag immer über dem des extrafokalen Lebergewebes. Dabei zeigte der Verlauf desLI während der Applikation in CCF immer, in den anderen FAH-Typen meist in der Tendenz Parallelen zwischen FAH und demextrafokalen Lebergewebe. Die fokalen Hepatozyten schienen nach Phenobarbital-Applikation in gleichem Maße, nach Ethinylestradiol-und 13wöchiger PCB-126-Verabreichung stärker, nach Chloroform und Wyeth-14,643-Gabe geringer als die extrafokalen Hepatozyten aufdie zellproliferationssteigernden Eigenschaften der Substanzen zu reagieren. Die Inhibition der Apoptose in FAH als Mechanismus der Promotion konnte in keiner Gruppe nachvollzogen werden. Die fünf Substanzen riefen unterschiedliche Proliferationsmuster im extrafokalen Lebergewebe hervor. Der Zusammenhang zwischenHauptproliferationszone des extrafokalen Lebergewebes und der Lokalisation der FAH innerhalb des Leberläppchens bei vier der fünfSubstanzen spricht für einen Einfluß der extrafokalen Proliferation auf die Promotion von FAH.

The aim of the investigation was the analysis of the impact of five different non-genotoxic carcinogens on the growth of spontaneouslydeveloped foci of altered hepatocytes (FAH) in the liver of old male Wistar rats (81-89 weeks). The chosen compounds representwell-known liver tumor promotors working through different mechanisms: phenobarbital, chloroform, Wyeth-14,643, ethinylestradiol andPCB 126. The rats were treated consecutively for 1, 4 and 13 weeks at doses which produce liver tumors after long term administration.Additionally, the effect of the substance application on cell proliferation in extrafocal rat liver tissue was analysed. The number of FAH/cm2, the average size of FAH (cell number/FAH-cross section), the labelling index (LI %) and the apoptotic index (AI%) were measured considering the different FAH-types for quantifying the growth of FAH. Cell proliferation in extrafocal hepatocytes wasmeasured using the LZM-method (lobule zonal measurement) described by BAHNEMANN and MELLERT (1997). FAH were identified and classified by histomorphological criteria (H&E) in combination with immunohistological detection of GST-P. Thelabelling index was determined in hepatocytes immunohistochemically by BrdU staining after implanting a 7-day osmotic minipump. Theapoptotic index was established by counting the apoptotic bodies (H&E). All animals investigated showed FAH. Clear cell foci (CCF) were the most frequent type of lesion (84-89 %) in the 3 control groups.Additionally, basophilic cell foci (BCF) and NAH were observed (4-8%). NAH are characterised by positive GST-P staining, but cannot beseen in H&E slides. Only after application of ethinylestradiol a statistically significant promoting effect in form of an increase in the total number of FAH/cm2has been observed. On closer inspection of the different FAH-types a promoting effect was shown in an increase in the number of specialFAH-types/cm2 (phenobarbital and PCB 126: ECF (eosinophilic cell foci), Wyeth-14,643: BCF, ethinylestradiol: BCF and MCF (mixed cellfoci)). Thus phenobarbital, Wyet-14,643 and PCB 126 promoted in old rats the same FAH-types described ininitiations-promotions-studies. With regard to the evaluated parameters the increase in cell proliferation exhibited the strongest clue to the promoting activity of thecompounds. With the exception of PCB 126 all substances caused a peak in cell proliferation in CCF (Wyeth-14,643: 7.8-fold,ethinylestradiol: 4.6-fold, chloroform: 3-fold, phenobarbital 1.9-fold) after 1 week followed by a decrease. The CCF in animals treated withchloroform, Wyeth-14,643 and ethinylestradiol showed a sustained increase in cell proliferation for 13 weeks. BCF, that representadvanced preneoplastic lesions in the carcinogenic process with a high potential for malignant transformation, exhibited a higher LI thanCCF after 1 week of administration in all substance groups (except of the Phenobarbital group). The LI in FAH (with exception of NAH) exceeded the extrafocal LI at all time points of investigation. The course of the LI during theapplication showed parallels in tendency between CCF and the extrafocal liver tissue generally and for the other FAH-types in most cases.The focal hepatocytes seemed to react to the same extent as the extrafocal hepatocytes to the cell proliferation increasing effects ofphenobarbital-, disproportionally strong to ethinylestradiol- and PCB 126-administration (only after 13 week administraion) and, to asomewhat lesser degree, to chloroform- and Wyeth-14,643-administration. An inhibition of the apoptotic process in FAH as promoting mechanism has not been observed. The five compounds caused different pattern of cell proliferation in extrafocal liver tissue. The association between zonal predominanceof extrafocal cell proliferation and zonal localisation of FAH after treatment reflected the influence of extrafocal cell proliferation for thepromotion of FAH by 4 of the 5 substances tested.