Darstellung von Estradiol-17beta- und Progesteronrezeptoren im Corpus luteum der Hündin zu definierten Zeitpunkten im Östrus und Diöstrus

Abstract

Nachdem weder ein uterines Luteolysin noch ein Mangel an Gonadotropinen (LH, Prolaktin) kausal mit der ab dem ersten Drittel desDiöstrus einsetzenden Luteolyse in Zusammenhang gebracht werden kann, lag vorliegender Arbeit die Arbeitshypothese zugrunde, dassauch beim Hund - analog zur Situation bei anderen Spezies - luteale Steroidhormone als parakrine/autokrine Faktoren eine Rolle bei derSteuerung der Corpus luteum Funktion spielen. Da eine solche Wirkung an die Expression spezifischer Rezeptoren gebunden ist, war es Ziel vorliegender Arbeit im Hinblick einerVerifizierung der aufgestellten These, die Expression von Progesteron- und Östrogenrezeptoren im Verlauf des Diöstrus im Corpus luteumingravider Hündinnen zu erfassen. Die Untersuchungen erfolgten immunhistochemisch unter Verwendung spezifischer Antikörper und Einbeziehung externer und internerKontrollen. Bei jeweils 4 Hündinnen unterschiedlicher Rassen wurden an den Tagen 5, 15, 25, 35 und 45 nach der Ovulation die Ovarien mittelsOvariohysterektomie entnommen, die Corpora lutea separiert, und für die Immunhistochemie in 4% Lilliformol fixiert und anschließend inParaffin eingebettet. 3 µm dicke Schnitte, aufgezogen auf mit Aminopropyltriethoxysilan beschichtete Objektträger, wurden durch eineXylol-Alkohol Reihe entparaffiniert, rehydriert und zur Demaskierung der Epitope einer Mikrowellenbehandlung mit Citratpuffer unterzogen.Zur Inaktivierung der endogenen Peroxidase folgte eine Überschichtung mit Wasserstoffperoxid in PBS-Puffer, zur Blockierungunspezifischer Proteinbindungsstellen die Überschichtung mit inaktivierten Pferdeserum; es schloss sich der immunhistochemischeRezeptornachweis an. Zum Nachweis von Progesteron- und Estradiol-17b-Rezeptoren kamen Antikörper aus dem Klon 10A9 bzw. 6F11zur Anwendung. Externe Kontrolle war Uterusgewebe vom 15. Tag post ovulationem, interne Kontrollen waren die periluteal liegendenFollikel. Zur Überprüfung unspezifischer Bindung an caninem Gewebe wurden in jedem Test zusätzliche Schnitte mitgeführt, bei denen derspezifische Primärantikörper durch einen 'nonsens' Antikörper aus dem Klon 7T4-1F5 bzw. CBL-600 in entsprechender Endverdünnungdes Proteins ersetzt wurde. Die lichtmikroskopische Auswertung der Präparate erfolgte bei 400-facher Vergrößerung. Pro Hund wurde ein Paraffinblock, d. h. ein Corpus luteum, herangezogen. Von diesem Block wurden 3 Schnitte gefärbt. Ausgezähltwurden je nach Schnitt 13 bis 21 Gesichtsfelder, wobei einem imaginären Kreuz gefolgt wurde. Die statistische Auswertung erfolgte mitdem Statistikprogrammpaket BMDP/Dynamic, Release 7.0 (Dixon 1993). Zu allen Untersuchungszeitpunkten ergaben sich Färbereaktionen, die das Vorkommen von PR und ER sowohl in den Luteinzellen als auchin den sonstigen Zellen anzeigten, wobei bei den Luteinzellen im Hinblick auf die nukleäre Reaktion zwischen 'positiven' und 'schwachpositiven' Zellen differenziert werden konnte. Daneben ergaben sich auch zytoplasmatische Signale. Weiterhin zeigten sich, bezogen aufdie Lokalisation, mehr positive Reaktionen in den Randfeldern als in den mittleren Feldern. Nur für den PR ließ sich ein Bezug zumZeitpunkt der Probenentnahme feststellen, obwohl die Expression des ER positiv mit der des PR korreliert war. DieProgesteronkonzentration im peripheren Plasma korrelierte negativ mit der Zahl der PR exprimierenden Luteinzellen und sonstigen Zellen.Diese Befunde weisen erstmals darauf hin, dass beim Hund den lokal im CL gebildeten Sexualhormonen Progesteron und Estradiol-17beine parakrine bzw. autokrine Funktion bei der Regulation der CL-Funktion zukommt. Inwieweit die Regulation der Expression der ER undPR im CL von den lokalen Verfügbarkeit von Progesteron und Estradiol-17b abhängt, kann derzeit nur spekulativ vermutet werden. In the dog neither an uterine luteolysine nor a lack of gonadotropins (LH, Prolaktin) seem to be functionally correlated to luteolysis whichcommences after the first third of diestrus. As a result of these observations the hypothesis was developed that in the dog, as in otherspecies, steroid hormones of luteal origin act as local paracrine/autocrine factors controlling luteal function. In order to test for this hypothesis the present work deals with the determination of progesterone and estrogene receptors during the courseof diestrus in corpora lutea of non-pregnant bitches. Immunhistochemical methods were applied using specific antibodies and adequateexternal and internal controls. Four bitches of different breeds were ovariohysterectomized on days 5, 15, 25, 35 and 45 after ovulation, corpora lutea were separatedfrom the ovaries obtained, fixed with Lillie formole (4%) and embedded in paraffin; 3 µm slices were placed on slides coated withaminopropyltriethoxysilane. The samples were then deparaffinized and dehydrated by treatment with xylene and alcohol, followed by amicrowave treatment in citrate-buffer for retrieval of epitopes. Endogenous peroxidase was inactivated by treatment with hydrogeneperoxide in phosphate buffered solution, unspecific binding sites were blocked by incubation with horse serum prior to performing theimmuncytochemical reaction. Antibodies derived from the clones 10A9 and 6F11 were used for detection of progesterone andestradiol-17b receptors, respectively. Uterine tissue obtained from a bitch 15 days after ovulation served as external control, follicles inperiluteal position served as sample inherent (internal) controls. To test for unspecific bindig in additional control samples the specificprimary antibody was replaced by a nonsens-antibody derived from the clones 7T4-1F5 and CBL-600, respectively. Nonsens and primaryantibodies were used in the same dilution. All slides were evaluated using a 400-fold magnification. Evaluation was restricted to one corpus luteum per dog. From each corpus luteum 3 slides were prepared, evaluation followed animaginary cross yealding between 13 to 21 views per slide. The program BMDP/Dynamic, Release 7.0 (Dixon 1993) was used forstatistical evaluation. At all time-points investigated positive staining reactions were observed, indicating the presence of progesterone and estradiol receptorsin luteal cells as well as in other cells. In respect to luteal cells a distinction was possible between positiv and weakly positiv nuclearreactions. Luteal cells also showed a cytoplasmic signal. There was a higher incidence of positive stained cells in the periphery and onlythe expression of the progesterone receptor was correlated to the stage of cycle. However, expression of the estrogene receptor was alsopositively correlated to the expression of the progesterone receptor. Progesterone concentrations in peripheral plasma were negativelycorrelated to the number of luteal cells expressing the progesterone receptor and the other progesterone receptor-positive cells. These are the first results indicating a paracrine/autocrine role of progesterone and estradiol in the regulation of luteal function in the dog.The observations warrant further studies to test for control of the expression of progesterone and estrogene receptors in the corpus luteumand the role of local luteal hormone concentrations.