Histopathologische, immunhistologische und biochemische Untersuchungen zur Prüfung der Wirksamkeit von Imexon im GalN/LPS-Modell der Maus unter besonderer Berücksichtigung der Milz

Abstract

Anhand des Einflusses auf den Krankheitsverlauf des GalN/LPS-Modells der Maus wurde die potentielle Bedeutung des 2-CyanaziridinsImexon als unterstützendes Therapeutikum für systemische bakterielle Infektionen und den septischen Schock untersucht. Das GalN/LPS-Modell ist gekennzeichnet durch einen hochakuten Verlauf. Todesfälle treten innerhalb der ersten fünf bis neun Stundennach Injektion der Toxine auf. Imexon senkte die Zahl der Todesfälle im vorliegenden Versuch um die Hälfte. Der Symptomenkomplex des Multi-Organ-Versagens (MODS), das als Folge der systemischen Entzündungsreaktionenen im Verlauf einerSepsis auftritt, ist in diesem Modell auf die selek-tive Schädigung der durch GalN sensibilisierten Leber reduziert. Die Stärke derLeberschädi-gung wurde beurteilt anhand des Plasmaspiegels der Transaminasen ASAT und ALAT, histologisch in der Färbung mit H.E.und immunhistologisch mit dem TUNEL-Test zur spezifi-schen Darstellung von Apoptosen. Imexon beeinflusste die untersuchtenBlutparameter positiv und reduzierte das Ausmaß der apoptotischen und nekrotischen Leberschädigung. Der Pathogenese im GalN/LPS-Modell liegen immunpathologische Mechanismen zugrunde, die auf der Wechselwirkung der bakteriellenLipopolysaccharide mit Abwehrzellen und -funktionen des betroffenen Organimus basieren. Zur Charakterisierung der Wirkmechanismenvon Imexon wurden verschiedene Populationen von Abwehrzellen in Leber und Milz, den in erster Linie am Krankheitsgeschehenbeteiligten Organen, immunhistologisch markiert und auf substanzbedingte Veränderungen der Zellen oder Zellverschiebungen hinuntersucht. Die Zell-verschiebungen wurden zusätzlich mittels zytofluo- und morphometrischer Untersuchungen quantifiziert. Imexon bewirkte bei verschiedenen Makrophagenpopulationen in der Leber sowie in der roten Pulpa und der Marginalzone der MilzVeränderungen der Morphologie der Einzelzelle und/ oder eine Zunahme der Expression des Antigens MAC-1 bzw. eine flächigereExpression der Antigene F4/80 und MOMA-1. Diese Veränderungen sind überwiegend Zeichen einer Aktivie-rung dieser Zellen undkönnen als Ausdruck der Beeinflussung von Makrophagen durch Imexon gewertet werden. Außerdem wurden in der Leber durch Vorbehandlung mit Imexon Zellinfiltrationen und Entzündungsreaktionen gehemmt. In der Milz warensowohl die LPS-spezifische B-Zell-wanderung von der Marginalzone in die Follikel als auch die Depletion verschiedener andererZellpopulationen reduziert bzw. deren Rückbildung beschleunigt. Diese Veränderun-gen korrelierten auch unter Einfluss derVergleichssubstanz Dexamethason mit der Stärke der LPS-induzierten Leberschädigung und gaben keinen weiteren Hinweis auf dieAngriffspunkte der Imexon-Wirkung. Durch die vorbeugende Behandlung mit Dexamethason konnte ein vollständiger Schutz vor der GalN/LPS-induzierten Leberschädigungerzielt werden. Dexamethason wirkt im GalN/LPS-Modell über eine Hemmung der Ausschüttung des Hauptmediators TNFa. Imexonhingegen hemmte den Anstieg des TNFa-Serumspiegels nicht, sondern führte unter großer Schwankungsbreite in manchen Fällen sogarzu einer zusätzlichen Erhöhung des Zytokin-spiegels. Die therapeutische Wirkung von Imexon war jedoch von der Erhöhung desTNFa-Serumspiegels unabhängig. Einen anderen Hinweis auf einen möglichen Ansatzpunkt der Wirkung von Imexon ergab die zytofluometrische Analyse von Blut und Milz. Inbeiden Kompartimenten war jeweils der Anteil einer Zellpopulation mit der Morphologie von Lymphozyten erniedrigt, die weder das B220-noch das CD3-Antigen exprimierte. Diese Veränderung trat nur unter Einfluss von Imexon auf und ist somit als substanzspezifischanzusehen. Unter Berücksichtigung v.a. auch der immunhistologischen Ergebnisse kann als ein Wirk-mechanismus von Imexon im GalN/LPS-Modelldie Beeinflussung von Makrophagen bzw. deren Aktivierung und Oberflächenantigenexpression nach Stimulation mit LPS postuliertwerden, die entweder jenseits der Ausschüttung des Hauptmediators TNFa angesiedelt ist oder zumindest vom systemischen Anstiegdieses Zytokins unabhängig ist. Das Verhalten der verschiedenen Lymphozytenpopulationen hingegen schien nicht spezifisch beeinflusstzu werden. Nur die Veränderungen der zytofluometrischen Untersuchungen könnten als Hinweis auf eine Wirkung von Imexon auf dieseZellpopulationen gewertet werden. Die meisten der untersuchten Parameter waren unter dem Einfluss von Imexon einer besonders breiten Streuung unterworfen. DieImexon-induzierten Veränderungen zellulärer Reaktionen und ihre Auswirkung auf den Krankheitsverlauf schienen in starkem Maße von derimmunolo-gischen Ausgangssituation des Organismus abzuhängen. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung lassen Imexon als unterstützendes, immun-modulatorisches Therapeutikum beiEndotoxin-bedingtem Krankheitsgeschehen als geeignet erscheinen. Eine weitergehende Analyse der zellulären Angriffspunkte und derimmunologi-schen Einflussgrößen, die die therapeutische Wirkung der Substanz beschränken, könnten die Sicherheit einesTherapie-Erfolges weiter steigern. The assumed relevance of the 2-cyanoaziridine Imexon as an adjuvant in systemic bacterial infections and septic shock was investigatedby examining the effect of this compound on the course of disease in the GalN/LPS mouse model. The GalN/LPS model is characterized by the acute nature of the disease. The majority of deaths occur in between the fifth and the ninthhour after the injection of the toxins. In the current study Imexon was found to be able to reduce the number of deaths by half. Mice develop a selective liver failure instead of the multiple organ dysfunction syndrome (MODS), as seen during sepsis, mice develop aselective liver failure. Hepatic injury was evaluated by the determination of transaminase serum levels and by histological examination. Thesections of the liver were stained with H.E. and with the In Situ Cell Death Detection Kit (TUNEL) for immunohistochemical detection ofapoptosis. Imexon reduced the activity increase of aspartate transaminase and alanine transaminase, and the number of apoptotic andnecrotic cells in the liver. The pathogenesis of GalN/LPS-hepatitis is based on immunopathological mechanisms involving complex interactions between bacteriallipopolysaccharides and the host immune cells and functions. To characterize the mode of action of Imexon different populations ofimmunological cells were identified by immunohistological staining procedures in liver and spleen, which were the mostly involved organs inthe pathogenesis in this model. These cells and their shifts were examined for histopathological changes specifically influenced by Imexon.Additionally,the cell shifts were quantified by cytofluometric and morphometric studies. Imexon caused changes of cell morphology within different macrophage populations. The expression of the antigen MAC-1 was increasedon the Kupffer cells in the liver, while the expression of the antigens F4/80 and MOMA-1 was spread on macrophage populations of the redpulp and the marginalzone of the spleen. These changes indicate, that the compound augments the activation of these cells. In addition, Imexon inhibited the infiltration of cells and, at least partially, the inflammatory reactions in the liver. It reduced the LPS specificmigration of B-cells from the splenic marginal zone to the follicles and the depletion of different cell populations in the spleen. It alsoaccelerated the regression of these changes. All these changes correlated with the degree of the LPS-induced hepatic injury even, if themice were pretreated with dexamethasone. Therefore no further information on the mode of action of Imexon could be derived from theseresults. The reference compound dexamethasone completely protected against the GalN/LPS-induced hepatic injury. The action ofdexamethasone is based on its inhibitory effect on the increase of TNFa serum levels in the GalN/LPS model. Imexon did not inhibit thisincrease but enhanced its release, at least in some animals, and it increased the mean variation of the TNFa serum level. The protectiveeffect of Imexon was not impaired by this additional increase. The cytofluometric analysis of blood and spleen revealed a decrease of the percentage of a population of cells similar to lymphocyte that donot stain with none of the monoclonal antibodies B220 and CD3 for each of the two compartments. This phenomenon occurred specificallyafter the treatment with Imexon and therefore could indicate another possible target of action of this immunomodulatory agent. Under particular consideration of the current studies histological results, it may be postulated that, in the GalN/LPS model, Imexoninfluences the functions of macrophages, theri activation, and the expression of antigens on the cell surface. This action may take placebeyond the secretion of the terminal mediator TNFa or is at least not related to the systemic release of this cytokine. Lymphocytepopulations did not appear to be specifically influenced by Imexon in this model except for the changes concerning the results of flowcytometry. The mean variation of the majority of the examined parameters was considerably increased under the influence of Imexon. TheImexon-induced changes of cellular reactions and their effect on the course of disease seemed to depend to a great extent on the actualimmunological state of the host. The results of the current study indicate, that the immunomodulatory compound Imexon may be of interest as an adjuvant in the treatment ofdiseases caused by endotoxin. A detailed analysis of its mode of action and of immunological factors that may limit its therapeutic effectcould further increase the safety of a successful therapeutic use of Imexon.