Einfluss verschiedener Konzentrationen von E. coli var. haemolytica und Gentamicin auf selektierte Vitalparameter in flüssigkonserviertem Rüdensperma

Abstract

Auch in der Hundezucht gewinnt die künstliche Besamung an Beliebtheit. Die Flüssigkonservierung des Spermas verknüpft sehr gute Besamungserfolge mit einer einfachen und kostengünstigen Handhabung. Darüber hinaus bietet sie die Möglichkeit, Samen kurzzeitig zu lagern und zu versenden und schließt damit die Lücke zwischen Frisch- und kryokonserviertem Sperma.In dieser Arbeit wurde die Bedeutung verschiedener E. coli var. haem.- und Gentamicinkonzentrationen auf die Spermaqualität und damit auf die Lagerfähigkeit von flüssigkonservierten Samen vom Rüden untersucht. Zudem sollte geprüft werden, inwiefern sich bakterielles Wachstum durch die verschiedenen Gentamicinkonzentrationen verhindern bzw. minimieren lässt. Die Ejakulate stammten von 11 Rüden und wurden für fünf Versuchsdurchläufe gepoolt. Der verwendete CaniPlus Chill® Verdünner setzte sich aus vier Chargen mit verschiedenen Konzentrationen (0, 20, 100 und 200 mg/l) von Gentamicin zusammen. Zu jedem der vier Verdünner wurden zusätzlich noch zwei E. coli var. haem.-Konzentrate (500 KBE/ml und 5× 105 KBE/ml) inokuliert. Des Weiteren wurde eine Negativkontrolle ohne weitere Keime angelegt. Diese 12 Testansätze wurden bei 4 °C im Kühlschrank gelagert und im Abstand von 24 h über 3 Tage spermatologisch (%-Lebend/Tot; %-morphologisch veränderter Spermien; %-membranintakte Spermien; CASA-Beweglichkeitsparameter) und bakteriologisch untersucht.Am Tag 0 direkt nach dem Verdünnen und vor dem Herabkühlen konnten folgende Werte ermittelt werden: Eine Beweglichkeit von 81,0 ± 2,4 %, Vorwärtsbeweglichkeit von 73,2 ± 2,6 %, Anteil lebender Spermien (Eosin-Ausstrich) von 75,1 ± 3,2 %, Anteil morphologisch normaler Spermien (Spermac®-Färbung) von 72,2 ± 11,5 % und membrandefekte Spermien (HOS-Test) von 9,7 ± 1,0 % (not curled). Insgesamt nahm die Spermaqualität über den Untersuchungszeitraum kontinuierlich ab, was sich in einer signifikanten Abnahme bis zu einer Beweglichkeit von 43,2 ± 21,5 % und Vorwärtsbeweglichkeit von 34,6 ± 20,3 %, eines Anteils lebender Spermien von 43,0 ± 13,3 % und membranintakte Spermien (HOS-Test) von 36,4 ± 17,8 % (curled) am Tag 3 und einer Zunahme des Anteils an morphologisch veränderten Spermien, inkl. Kopfkappen von 58,94 ± 4,09 % am Tag 3 äußerte. Ferner konnte ein negativer Einfluss der Gentamicinkonzentration nachgewiesen werden: Testansätze, die mit 200 mg/l Gentamicin versetzt waren, zeigten eine signifikant stärkere Reduktion der Beweglichkeit (12,7 ± 8,4 %) und Vorwärtsbeweglichkeit (4,2 ± 4,6 %), des Anteils lebender Spermien (21,5 ± 8,1 %) und membranintakter Spermien (52,0 ± 26,4 %). Eine Zunahme morphologisch veränderter Spermien oder Kopfkappen (52,0 ± 9,0 %) konnte nicht festgestellt werden.Infolge der verschieden hohen E. coli var. haem.- Konzentrationen manifestierte sich ein signifikanter Unterschied im Anteil (%) morphologisch veränderter Spermien, von Tag 0 (BK 0: 20,6; BK 1: 25,4; BK 2: 29,5 %) bis hin zu Tag 3 (BK 0: 38,9; BK 1: 40,5; BK 2: 45,2 %; p = 0,0069).Die bakteriologische Analyse ließ eine Verringerung der Keimzahlen in allen Testansätzen erkennen. Am deutlichsten stellte sich die Abnahme bei 200 mg/l Gentamicin dar, wobei nach 24 h nur noch einzelne Kolonien und nach 48 h kein Wachstum mehr nachgewiesen werden konnte. Bei 20 mg/l Gentamicin wuchsen in Verbindung mit der hohen E. coli var. haem.-Zugabe am Ende des Versuchs noch 656 KBE/ml, bei 100 mg/l Gentamicin noch 52 KBE/ml.Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der Verdünner mit 100 mg/l Gentamicin im Vergleich zu den übrigen Verdünnern am besten für die Flüssigkonservierung geeignet war. Er bot eine moderate Keimreduktion, ohne dabei die Spermaqualität negativ zu beeinträchtigen. Inwiefern Gentamicin die Verschlechterung der Samenparameter verschuldete, bleibt unklar, da andere Studien erst bei höherer Dosis einen Effekt feststellten. Auch in einem Folgeversuch konnte bei 200 mg/l Gentamicin keine Abnahme der Vitalparameter festgestellt werden, sodass für die vorliegende Arbeit auch andere, verdünnerassoziierte Faktoren als Ursache diskutiert werden müssen. Die Inokulation mit dem E. coli var. haem.-Stamm erbrachte nur eine geringe Abnahme einzelner Qualitätsparameter und scheint deshalb von untergeordneter klinischer Relevanz. Inwieweit das auch auf andere Stämme und Serovare zutrifft, wurde bisher nicht untersucht.Zuletzt bleibt auch ungeklärt, in welchem Ausmaß sich die Fertilität des kühlkonservierten Ejakulats durch die getesteten Variablen verändert. So sind weitere Studien notwendig, um auch die Befruchtungsfähigkeit in vivo näher beurteilen zu können. Artificial insemination is gaining more and more popularity in dog breeding. The chilled semen preservation combines very good insemination results with a simple and cost-effective handling. In addition, it offers the possibility to store and send semen at short notice, thus closing the gap between fresh and cryopreserved sperm.This study investigated the importance of different ECH (E. coli var. haem.) and gentamicin concentrations on sperm quality and thereby on the storage capacity of chilled canine semen. In addition, the extent to which bacterial growth can be prevented or minimized by the different gentamicin concentrations should be examined. The ejaculates were collected from 11 male dogs and were pooled for a total of five trials. The CaniPlus Chill extender used was composed of four batches with different concentrations (0, 20, 100 and 200 mg/l) of gentamicin. Each of the four diluents was additionally inoculated with two concentrates (500 CFU/ml and 5× 105 CFU/ml) of ECH. Furthermore, a negative control without bacteria was generated. These 12 test samples were stored in the refrigerator at 4 °C. The semen was evaluated for % -living/dead; % -morphologically altered spermatozoa; % -membrane-intact spermatozoa; CASA-mobility parameters at intervals of 24 hours for 3 days. A bacteriological examination of the test samples was carried out on the same schedule. On day 0, immediately after dilution and before cooling down, the following values were determined: mobility of 81.0 ± 2.4 %, forward mobility of 73.2 ± 2.6 %, percentage of living spermatozoa (eosin staining) of 75.1 ± 3.2 %, proportion of morphologically normal spermatozoa (Spermac® staining) of 72.2 ± 11.5 % and of membrane-defective spermatozoa (HOS test) of 9.7 ± 1.0 % (not curled). Overall, sperm quality decreased continuously over the study period, resulting in a significant decrease of motility to 43.2 ± 21.5 % and progressive motility to 34.6 ± 20.3 %, the proportion of living spermatozoa of 43.0 ± 13.3 % and membrane-intact spermatozoa (HOS test) of 36.4 ± 17.8 % (curled) on day 3, and an increase in the proportion of morphologically altered spermatozoa, including detached acrosomes, of 58.9 ± 4.1 %. In addition, a negative influence of the gentamicin concentration could be detected: Samples supplemented with 200 mg/l of gentamicin showed a significantly greater reduction in motility (12.7 ± 8.4 %) and progressive motility (4.2 ± 4.6 %), the percentage of living spermatozoa (21.5 ± 8.1 %) and membrane-intact spermatozoa (52.0 ± 26.4 %). An increase of morphologically altered spermatozoa or acrosomes (52.0 ± 9.0 %) could not be detected.Due to the different concentrations of ECH, a significant difference was found in the proportion of morphologically altered spermatozoa (%) from day 0 (BK 0: 20.6; BK 1: 25.4; BK 2: 29.5) to day 3 (BK 0: 38.9, BK 1: 40.5, BK 2: 45.2) (p = 0,0069). The bacteriological analysis showed a reduction of the bacteria in all samples. The decrease was most pronounced at 200 mg/l of gentamicin, whereas after 24 hours only single colonies and after 48 hours no bacterial growth could be detected. At 20 mg/l of gentamicin in combination with the high ECH additive, 656 CFU/ml were still grown at the end of the experiment, and 52 CFU/ml at 100 mg/l of gentamicin.The results of this work show that the extender with 100 mg/l of gentamicin was best for chilled semen preservation compared to the other extenders. It offered a moderate bacterial reduction without adversely affecting sperm quality. To which extent gentamicin was responsible for the deterioration of the sperm parameters remains unclear, since other studies only detected an effect at a higher concentrations. Also in further studies no decrease in the vital parameters could be determined at 200 mg/l of gentamicin. For that reason, other, extender-associated factors must also be discussed.Inoculation with the used ECH strain yielded only a slight decrease in single quality parameters and therefore seems of minor clinical relevance for subfertility. To what extent this also applies to other bacterial strains and serovars has not yet been investigated.Finally, it remains unclear as to which degree the fertility of chilled canine semen is affected by the tested variables. Further studies are necessary in order to be able to assess the fertilization capacity in vivo.