Der Sodium-dependent Organic Anion Transporter SOAT : Substratspektrum, genetische Varianten im Menschen und Effekte in der Soat Knockout Maus

Abstract

Der Sodium-dependent Organic Anion Transporter SOAT/Soat (Genname SLC10A6 Mensch und Slc10a6 Tier) ist ein hochspezifischer Aufnahme-Transporter für sulfokonjugierte Steroidhormone, welche eine große strukturelle Ähnlichkeit untereinander aufweisen. SOAT-Substrate sind durch ein planares, lipophiles Steroid-Gerüst mit einer Ring-Konformation in trans-trans-trans-Stellung gekennzeichnet. Außerdem weisen sie eine negativ geladene Monosulfat-Gruppe an den Positionen C3 oder C17 auf, die sowohl in alpha-, als auch in beta-Konstellation auftreten kann. Strukturell gesehen spielt es also keine Rolle auf welcher Seite des Moleküls die Sulfat-Gruppe angehängt ist. Darüber hinaus sind 5alpha-Reduktion, sowie 16alpha- und 17alpha-Hydroxylierung für die Substraterkennung von SOAT akzeptabel, während das Vorhandensein einer zweiten, negativ geladenen Sulfatgruppe den Substrattransport verhindert.SOAT zeigt im Menschen eine prädominante Expression im Hoden und wird in der Maus vor allem in Lunge, Haut und Hoden exprimiert. In beiden Spezies wurde das Protein besonders in Spermatiden und Spermatozyten detektiert, was darauf schließen lässt, dass SOAT/Soat im Hoden von Maus und Mensch die gleiche Funktion einnimmt. Darüber hinaus wurde eine signifikante Reduktion der SOAT-mRNA-Expression bei verschiedenen Störungen der Spermatogenese im Menschen gefunden. Aus diesen Gründen könnte SOAT/Soat eine Rolle für die lokale Versorgung mit Steroiden im Hoden spielen und damit auch einen Einfluss auf die männliche Fruchtbarkeit nehmen.Um der Aufklärung der physiologischen Funktionen des SOAT/Soat in Bezug auf Fruchtbarkeit und Spermatogenese näher zu kommen wurden zwei Strategien verfolgt: Neben der Analyse funktionell relevanter, genetischer Varianten von SOAT, die mit einer gestörten Spermatogenese korreliert sein könnten, wurde ein Slc10a6-Knockout-Maus-Modell etabliert, um Physiologie und Pathophysiologie des Transporters in Bezug auf Reproduktionsverhalten, Fertilität und Samenqualität in vivo zu evaluieren.Unter den 31 analysierten SOAT-Varianten zeigten nur zwei eine erhaltene Transportaktivität für [3H]DHEAS. Alle anderen SOAT-Varianten weisen hingegen einen verminderten Substrat-Transport auf. Einige dieser funktionsbeeinträchtigen Varianten zeigten darüber hinaus eine signifikant reduzierte Expression in der Plasmamembran, während andere Varianten an oder in direkter Nachbarschaft zu den mutmaßlichen Natrium-Bindungsstellen lokalisiert sind. Eine verminderte Expression in der Plasmamembran kann einen negativen Effekt auf die Transportrate haben, während ein beeinträchtigter Transport nicht notwendigerweise die Plasmamembranexpression beeinflusst. Die Varianten, die in unmittelbarer Nähe zu oder direkt an den Natrium-Bindungsstellen lokalisiert sind, beeinflussen die SOAT-Transportaktivität wahrscheinlich, indem sie Na+ von seiner Bindung an den jeweiligen Bindungsstellen abhalten und somit auch den Natrium-abhängigen Transport der Substrate verhindern. Die Slc10a6-/- -Knockout-Mäuse sind fruchtbar, produzieren normale Wurfgrößen und zeigen eine normale Spermatogenese und Spermienvitalität. Möglicherweise kann der Verlust der Soat-Expression in den Knockout-Mäusen kompensiert werden, da der Knockout konstitutiv ist und nicht erst konditionell verursacht wird. Außerdem ist denkbar, dass die Soat-Funktion trotz allem kein wesentlicher Bestandteil des Reproduktionsgeschehens ist. Zusätzlich zur reproduktiven Phänotypisierung wurde eine Steroidanalyse mit 9 unkonjugierten und 12 sulfokonjugierten Steroiden im Serum von Slc10a6-/- -Knockout- und Slc10a6+/+ -Wildtyp-Mäusen durchgeführt. Im Zuge dessen wurden in den männlichen Slc10a6-/- -Knockout-Mäusen, im Vergleich zum Wildtyp, signifikant höhere Serumspiegel für Cholesterin-Sulfat nachgewiesen. Dies könnte möglicherweise eine Bedeutung für die Haut haben, welche auf eine Ansammlung von CS mit einer Ichthyose reagiert. The Sodium-dependent Organic Anion Transporter SOAT/Soat (gene SLC10A6 in humans, Slc10a6 in animals) is a highly specific uptake carrier for sulfo-conjugated steroid hormones, which show a high degree of structural similarity. SOAT substrates are characterized by a lipophilic steroid backbone with a trans-trans-trans conformation of the steroid rings. In addition, all SOAT substrates show a negatively charged mono-sulfate group at position C3 or C17, which can occur in both alpha- and beta-conformation. Structurally, it does not matter on which side of the molecule the sulfate group is attached. In addition, 5alpha-reduction, as well as 16alpha- and 17alpha-hydroxylation are acceptable for SOAT substrate recognition, while the presence of a second, negatively charged sulfate group seems to prevent substrate binding.In humans, SOAT is predominantly expressed in the testes. In mice, Soat shows largest expression in lungs, skin and testes. In both species, the protein was detected particularly in spermatids and spermatocytes, suggesting that SOAT/Soat fulfills a similar function in the testes of both humans and mice. In addition, a significant reduction of SOAT mRNA expression has been found in various disorders of spermatogenesis in humans. For these reasons, SOAT/Soat could play a role in the local supply of steroids in the testes and thus could have an effect on male fertility.In addition to analyzing functionally relevant genetic variants of SOAT that might be correlated with disturbed spermatogenesis, an Slc10a6 knockout mouse-model was established to evaluate the transporter´s physiology and pathophysiology in terms of reproduction, fertility and semen quality in vivo.Among the 31 SOAT variants analyzed, only two showed preserved transport activity for [3H]DHEAS. All other SOAT variants, however, were functionally impaired. In addition, some of these loss-of-function variants showed significantly reduced plasma membrane expression, while others are located directly at or adjacent to the putative sodium binding sites. Decreased expression in the plasma membrane may have a negative effect on the transport rate, whereas impaired transport does not necessarily affect plasma membrane expression. The variants, which are located in close proximity to or directly at the sodium binding sites, probably influence the SOAT transport activity by preventing Na+ from binding to the respective binding sites and thus also preventing the sodium-dependent transport of the substrates. The Slc10a6-/- -knockout mice do not show any visible aberrations. They are fertile, produce normal litter sizes and show normal spermatogenesis and sperm vitality. It is possible, that the loss of Soat expression can be compensated in the knockout mice, since the knockout is indeed constitutive and not caused conditionally. In addition, it is conceivable that notwithstanding, Soat function is not an essential part of the reproduction process. In addition to reproductive phenotyping, steroid analysis was performed with 9 unconjugated and 12 sulfoconjugated steroids in the serum of Slc10a6-/- -knockout and Slc10a6+/+ -wild type mice. As a result, in the male Slc10a6-/- -knockout mice significantly higher serum cholesterol sulfate levels were detected, in comparison to the wild type.