Untersuchungen zur Assoziation zwischen Alloantikörpern bei Rindern und der Bovinen Neonatalen Panzytopenie

Abstract

Die Bovine Neonatale Panzytopenie (BNP) ist eine seit Ende 2006 beobachtete, oft tödliche verlaufende Krankheit bei neugeborenen Kälbern in Europa. Das klinische Bild der BNP ist geprägt von einer stark erhöhten Blutungsneigung, einer extremen Thrombozytopenie und Leukozytopenie sowie von einer massiven und in vielen Fällen irreversiblen Knochenmarksschädigung. Die Ursache der BNP war zunächst unbekannt. Zu Beginn der in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen deuteten erste experimentelle Daten darauf hin, dass BNP eine immunpathologische Erkrankung ist, bei der impfinduzierte maternale Allo-AK, die von empfänglichen Kälbern mit dem Kolostrum aufgenommen werden, ursächlich sind. Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren deshalb, den epidemiologischen Zusammenhang zwischen dem Auftreten von BNP-Fällen und von Allo-AK bei Rindern näher zu beleuchten und die nachgewiesenen Allo-AK, vor allem bezüglich ihrer Wirkung auf die Zielzellen, näher zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurde auf Basis des von Bridger et al. (2011) entwickelten Tests eine Durchflusszytometrie-Methode (DFZM-Allo-AK-Test) etabliert, mit dem Allo-AK in Serum- und Kolostrumproben von Rindern unter Verwendung verschiedener Testzellen sowohl qualitativ als auch quantitativ nachweisbar sind. Als Testzellen wurden Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten und Thrombozyten aus dem Blut gesunder Spenderkälber sowie Zellen der bovinen Linien BL-3 und MDBK verwendet. Für die serologischen Untersuchungen standen Serum- und Kolostrumproben (n = 166 bzw. n = 13) von weiblichen Rindern aus zwei PregSure® BVD-Impfbetrieben sowie Serumproben aus einem Bovilis® BVD-MD-Impfbetrieb (n = 50) und einem Bovidec®-Impfbetrieb (n = 50) zur Verfügung. Als Kontrollproben dienten Serum- und Kolostrumproben (n = 50 bzw. n = 3) aus zwei Betrieben, in denen nicht gegen BVDV geimpft wurde und welche im Sinne der BVDV-Verordnung als BVD-unverdächtig galten (Kontrollbetriebe). Einige Serum- (n = 27) und Kolostrumproben (n = 7) aus den PregSure® BVD-Impfbetrieben stammten von Kühen, die wenigstens einmal ein Kalb geboren hatten, das später an BNP erkrankt war (BNP-Mütter). Zur Bestimmung der Immunglobulinklasse und des IgG-Subtyps der Allo-AK wurde der DFZM-Allo-AKMDBK-Test unter Verwendung entsprechender kommerzieller Sekundärantikörper eingesetzt. Die Prüfung der Rinderseren auf ihre zytotoxische Wirkung erfolgte mit dem MTT-Test an MDBK-Zellen, ihre Apoptose- und Nekrose-induzierende Aktivität wurde DFZM-basiert mit dem Annexin V-FITC Assay Kit (Fa. AbD Serotec) analysiert. In einem DFZM-basierten Phagozytose-Test wurde geprüft, ob Allo-AK-haltige Rinderseren die Zytophagozytose von BL-3-Zellen durch bovine Makrophagen in vitro zu stimulieren vermögen. Bovine Neonatal Pancytopenia (BNP) has emerged since the end of 2006 as a new life-threatening disease affecting neonatal calves in Europe. The clinical picture is characterized by increased susceptibility to bleeding, extreme thrombocytopenia and leucopenia and severe bone marrow damage which in many cases is irreversible. The etiology of BNP was unknown at first. At the time when the investigations described in this work were started symptoms, cytological, pathological and histological findings gave rise to the assumption that an immune-mediated mechanism including maternal alloantibodies (allo-Abs) was involved in the pathogenesis of BNP.Therefore, the aim of this study was to further elucidate the epidemiological link between cases of BNP and the presence of allo-Abs in female bovines and to characterize the features of the allo-Abs in more detail especially concerning their effect on the target cells. For this purpose the flow cytometry (FC) assay (FC-allo-Ab-assay) as published by Bridger et al. (2011) was developed further in order to assess allo-Abs in bovine serum and colostrum samples qualitatively and quantitatively by using different cells as test antigens. Lymphocytes, monocytes, granulocytes and thrombocytes isolated from the blood of healthy donor calves as well as the bovine cell lines BL-3 cells and MDBK cells were used as test cells. Serum and colostrum samples, respectively (n = 166, n = 13), from two PregSure® BVD-vaccinated herds as well as serum samples from a Bovilis® BVD-MD-vaccinated herd (n = 50) and a Bovidec®-vaccinated herd (n = 50) were available for testing in the different FC-allo-Ab-assay formats. Serum and colostrum samples (n = 50, n = 3) from two herds unsuspicious of BVDV and without vaccination history against BVDV served as controls (control herds). Some of the samples from the PregSure® BVD-vaccinated herds (27 serum samples, 7 colostrum samples) originated from cows which had given birth to at least one calf suffering from BNP (BNP mothers). In order to determine the immunoglobulin class and subtype of the allo-Abs we used the FC-allo-AbMDBK-assay applying different commercially available secondary antibodies. Possible cytotoxic effects of the bovine serum samples were tested in the cytotoxicity assay (MTT assay) using MDBK cells. The capability of allo-Abs to induce apoptosis and/or necrosis was analysed by flow cytometry using the Annexin V-FITC Assay Kit (Fa. AbD Serotec). In a FC-based phagocytosis assay the capability of allo-Ab-positive bovine sera to stimulate cytophagocytosis of BL-3 cells by bovine macrophages in vitro was investigated.