Nachweis von Gelatinase- und Kollagenase-Aktivität sowie von Matrix-Metalloproteinasen in der gingivalen Sulkusflüssigkeit bei der Parodontitis des Hundes

Abstract

Gelatinasen und Kollagenasen sind Enzyme, welche Gelatine und Kollagen abbauen. Dazu gehören die Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Diese Enzyme spielen eine wichtige Rolle bei der Parodontitis des Hundes, da sie das parodontale Ligament abbauen und somit am Verlust der Zähne und Zahnschmerzen beteiligt sind. Diese Enzyme werden durch neutrophile Granulozyten im Rahmen einer körpereigenen Entzündungsreaktion entlassen. Als Trigger für diese Reaktion dienen Bakterien. In der vorliegenden Arbeit werden die gelatinolytische und kollagenolytische Aktivität bei Hunden mittels Aktivitätsassay untersucht. Außerdem werden das Vorliegen und der Gehalt von ausgewählten Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) in der kaninen gingivalen Sulkusflüssigkeit bei zahngesunden Hunden und bei, in unterschiedlichen Graden, an einer Parodontalerkrankung leidenden Hunden mittels ELISA untersucht. Eine entsprechende Untersuchung liegt in der Veterinärmedizin bisher nicht vor. Bei Durchführung des Aktivitätsassays sowohl mit Gelatine als auch mit Kollagen als Substrat lässt sich die aufgestellte Hypothese, dass es mit steigendem Schweregrad einer Parodontalerkrankung, auch insgesamt zu einem Anstieg der enzymatischen Aktivität kommt, bestätigen. Bei der Untersuchung der absoluten Aktivität handelt es sich dabei um hoch signifikante Ergebnisse (p=0,0003, p<0,0001). Bei der Untersuchung der relativen Aktivität handelt es sich um signifikante (p=0,0307) und sehr signifikante (p=0,0021) Ergebnisse.Bei Untersuchung der Zusammenhänge zwischen der Enzymaktivität der Patientengruppe und der Kontrollgruppe bestehen bei Betrachtung auf Zahnebene hoch signifikant höhere relative Gelatinaseaktivitäten für die Patientenzähne a1 (p=0,0006), a2 (p=0,0003), e1 (p=0,001) und e2 (p=0,0006) gegenüber den entsprechenden Kontrollzähnen. Das gleiche gilt für die Patientenzähne a2 (p=0,0003) im Kollagenassay.Bei Betrachtung der Zusammenhänge zwischen der enzymatischen Aktivität aller Zähne der Patientengruppe und der Kontrollgruppe unabhängig von der Art des Zahns zeigt sich die relative Gelatinase- und Kollagenaseaktivität von Patientenzähnen höher als die der Kontrollzähne. Die Ergebnisse sind hoch signifikant (p<0,0001, p=0,0002). Ebenfalls hoch signifikant (p=0,0001) sind die Ergebnisse bei Untersuchung der Zusammenhänge zwischen der Enzymaktivität der Patientengruppe und der Kontrollgruppe auf Probandenebene. Hierbei ist die relative Gelatinaseaktivität der Patienten gegenüber den Kontrollen erhöht.Bei Untersuchung der Auswirkung der Zahnlokalisation auf die Enzymaktivität und dementsprechend den Schweregrad der Parodontalerkrankung, wenn dieser als Gesamtbefund aus klinischer und radiologischer Untersuchung erhoben wird, zeigen sich hoch signifikante (p=0,0007) Ergebnisse für den Zahn d. Für diesen Zahn kann also ein Anstieg der absoluten Kollagenaseaktivität entsprechend dem Anstieg des Schweregrades der Parodontalerkrankung nachgewiesen werden.An den Eckzähnen im Oberkiefer lässt sich in dieser Studie kein Unterschied in der Enzymaktivität zwischen der Probenentnahme palatinal oder bukkal feststellen. Die Ergebnisse der relativen Gelatinaseaktivität an den palatinalen und bukkalen Probenentnahmestellen stimmen hoch signifikant überein (p<0,001), die Ergebnisse der absoluten Gelatinase- und Kollagenaseaktivität und der relativen Kollagenaseaktivität sind sehr signifikant bis signifikant übereinstimmend (p=0,002-0,03).In der vorliegenden Arbeit können mit Hilfe des ELISA sowohl bei Zähnen von Tieren aus der Kontrollgruppe als auch aus der Patientengruppe MMP-2, -3 und -9 nachgewiesen werden. Die Untersuchungen zum MMP-Gehalt sind lediglich deskriptiv auf Grund der niedrigen Fallzahlen. Die aufgestellte Vermutung, dass es mit steigendem Grad der Parodontalerkrankung zu einem schrittweisen Anstieg im MMP-Gehalt kommt, kann auf Basis der vorliegenden Daten für keines der untersuchten MMPs bestätigt werden. Allerdings kann für MMP-2 und -3 bestätigt werden, dass es bei erkrankten Zähnen bzw. Patientenzähnen insgesamt zu höheren MMP-Gehalten kommt, als bei gesunden Zähnen bzw. Kontrollzähnen. MMP-8 wird insgesamt mit dem höchsten Gehalt nachgewiesen, aber lediglich in der Patientengruppe untersucht.Abschließend ist festzuhalten, dass in der vorliegenden Studie nachgewiesen werden kann, dass es bei der Parodontitis des Hundes mit steigendem Schweregrad der Erkrankung zu einem Anstieg der enzymatischen Aktivität von Gelatinasen und Kollagenasen in gingivaler Sulkusflüssigkeit kommt. Auf Grund des Nachweises von höheren Gehalten an MMP-2 und -3 bei Patienten gegenüber Kontrollen ist von einer Beteiligung dieser MMPs beim Fortschreiten der Erkrankung auszugehen. MMP-8 und -9 können ebenfalls nachgewiesen werden. Gelatinases und collagenases are enzymes that break down gelatin and collagen like for example matrix metalloproteinases. Since MMPs disintegrate the periodontal ligament they play an important role in periodontitis of the dog and are involved in tooth loss and concomitant pain. These enzymes are released by neutrophil granulocytes during the body s own inflammatory response to local bacteria.In the present study gelatinolytic and collagenolytic activity in dogs is measured via enzyme activity assay. In addition the presence and the amount of selected MMPs in gingival crevicular fluid of dogs with different degrees of periodontal disease and without periodontitis are studied via ELISA. An equivalent investigation has not yet been conducted in veterinary medicine.The hypothesis that an increase in gelatinolytic and collagenolytic activity occurs with increasing degree of periodontal disease can be verified. Regarding absolute activity the results are highly significant (p=0,0003, p<0,0001), regarding relative activity the results are statistically significant (p=0,0021, p=0,0307). When investigating the correlation between enzymatic activity of the patient group and the control group on the level of the tooth there are highly significant higher relative gelatinolytic activities in the patient teeth a1 (p=0,0006), a2 (p=0,0003), e1 (p=0,001) und e2 (p=0,0006) compared to the corresponding control teeth. The same applies to the patient teeth a2 (p=0,0003) in the collagenolytic activity assay.When looking at the connection between enzymatic activity of all teeth, independent to their type, the relative gelatinolytic and collagenolytic activities of the patient teeth are higher than those of the control teeth. The results are highly significant (p<0,0001, p=0,0002). Also highly significant (p=0,0001) results are achieved regarding the enzymatic activity of the patient and control group on the level of the dog. The gelatinolytic activity of the patients is higher than that of the control animals.Investigating the dependence of tooth location on total enzyme activity (cumulative diagnosis out of clinical and radiological findings) or degree of periodontal disease highly significant results are gained for tooth d (p=0,0007). For tooth d an increase in absolute collagenolytic activity in correspondence to an increase in disease severity can be proven.No difference in enzyme activity can be detected when sampling palatinally in contrast to buccally at the canines in the upper jaw. The results of the relative gelatinolytic actitivity of the palatinal and the buccal sampling site match in a highly signficant manner (p<0,001) whereas the results of the absolute gelatinolytic activity and the relative and absolute collagenolytic activity match significantly (p=0,002-0,03). In the present work MMP-2, -3 and -9 can be detected via ELISA in patients with periodontal disease and in periodontally healthy animals. Due to low sampling numbers the results concerning the amount of MMPs are only descriptive. The hypothesis that an increase in disease severity results in a gradual increase of MMP amount cannot be proven in this study. It can however be stated that total MMP-2 and -3 levels in patient teeth or periodontally diseased teeth are higher in comparison to control teeth or periodontally healthy teeth. MMP-8 levels in patients outnumber those of the other MMPs but they are not measured in the control group.Finally, in the present work the increase of gelatinolytic and collagenolytic activity in gingival crevicular fluid of the dog corresponding to the severity of the periodontal disease can be proven. An increase in MMP-2 and -3 levels in patients compared to control animals proves an involvement of MMPs in the disease progress. The presence of MMP-8 and -9 in periodontitis can also be demonstrated.