Untersuchung des Gallensäurestoffwechsels der Slc10a5 Knockout-Maus

Abstract

Seit mehr als einem Jahrzehnt ist SLC10A5 nun Mitglied der Familie der natriumabhängigen Gallensäuretransporter. Diese Verwandtschaft ließ, basierend auf den Gründungsmitgliedern der SLC10 Familie NTCP und ASBT, schon früh die Hypothese aufkommen, dass SLC10A5 ebenfalls ein Protein der Gallensäurehomöostase ist. Die favorisierte Funktion war dabei die eines Gallensäuretransporters.Die erste Bestätigung dieser Theorie lieferte die Regulation von SLC10A5 durch den Kernrezeptor FXR, der das Haupt-Steuerglied der Gallensäurehomöostase ist. Eine Funktion von SLC10A5 als Transportprotein für Gallensäuren konnte bislang nicht gezeigt werden. In dieser Arbeit wurde eine potentielle Transportfunktion von SLC10A5 weiter untersucht. Dazu wurden zum einen Zellen genutzt, die eine stabil transfizierte Chimäre aus SLC10A5 und dem C-Terminus von NTCP in das Genom eingebaut hatten und dadurch eine Plasmamembranlokalisation von SLC10A5 ermöglichten. Zum anderen wurden Membranvesikel aus stabil transfizierten SLC10A5 Zellen generiert, in denen ein Transport gezeigt werden sollte. Aber auch in diesen Messungen konnte keine Transportaktivität von SLC10A5 für die untersuchten Gallensäuren gezeigt werden.Der zweite Teil der De-Orphanisierung von SLC10A5 war die subzelluläre Lokalisation. Bereits in vorangegangenen Experimenten und Arbeiten zeigte sich ein streng intrazelluläres Expressionsmuster des Proteins, das der Expression bereits beschriebener Mitglieder der SLC10-Familie widersprach. In der vorliegenden Arbeit wurde dieses intrazelluläre Expressionsmuster in Leber- und Nierenschnitten von Mäusen durch die Verwendung eines speziell gegen den C-Terminus von SLC10A5 generierten Antikörpers bestätigt. Die Spezifität dieses Antikörpers konnte in Schnitten von Slc10a5-/- Knockout-Mäusen verifiziert werden. Die subzelluläre Lokalisation von SLC10A5 sollte durch Kolokalisation des Proteins mit organellenspezifischen Markern in der Lebendzellmikroskopie untersucht werden. Hier zeigten sich die größten Überschneidungen der Signale im endo-lysosomalen Apparat und dem ER. Eine Anreicherung des fluoreszenzmarkierten SLC10A5 im endo-lysosomalen Apparat war vermutlich auf die physikochemischen Eigenschaften des Fusionsproteins und die artifizielle Überexpression und Degradierung im Zellkulturmodell zurückzuführen. Im Kontext vorangegangener Arbeiten und dem intrazellulären Gallensäurestoffwechsel ist die Lokalisation im ER die favorisierte physiologische Lokalisation von SLC10A5 in dieser Arbeit.Aufbauend auf dem Pilotversuch mit der Slc10a5-/- Knockout-Maus von Aretz (2015), der einen massiven Einfluss von SLC10A5 auf die Entgiftung des mit Cholsäure überladenen Enterohepatischen Kreislaufs der Gallensäuren zeigte, sollte in der vorliegenden Arbeit eine Funktion von SLC10A5 unter physiologischen Bedingungen und ein Anteil am Energiestoffwechsel gezeigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass in der männlichen Slc10a5-/- Knockout-Maus unter Standardhaltungsbedingungen die Konzentrationen der konjugierten Gallensäuren Taurodeoxycholat und Taurohyodeoxycholat in der Galle und deren dekonjugierte Formen im Darminhalt signifikant erhöht waren. Zusätzlich waren höhere Deoxycholat-Konzentrationen im Blut des peripheren Kreislaufs messbar. In den weiblichen Mäusen traten keine signifikanten Unterschiede der Gallensäureprofile auf. Diese Ergebnisse deuten zumindest in den männlichen Tieren darauf hin, dass SLC10A5 gemeinsam mit Cytochrom P450 Oxidasen an der Rehydroxylierung sekundärer Gallensäuren im ER von Leberzellen beteiligt sein könnte. Eine Beeinträchtigung des Energiestoffwechsels der Slc10a5-/- Knockout-Maus konnte nicht gezeigt werden. Verschiebungen der Hydrophobizitätsindizes des Gallensäurepools in der Galle, dem peripheren Blut und dem Kot zeigen jedoch, dass der Verlust von SLC10A5 auch unter normalen Bedingungen einen Einfluss auf die physiologische Balance des Gallensäurestoffwechsels von Mäusen hat und eröffnet ein breites Spektrum an Untersuchungsmöglichkeiten für zukünftige Arbeiten mit SLC10A5 More than a decade ago SLC10A5 was introduced as a new member of the family of sodium dependent bile acid transporters. The sequence homology, which was based on the two first described SLC10 family members NTCP and ASBT, led to the hypothesis of SLC10A5 as a protein relevant for bile acid homeostasis. At this time the favored molecular function was a transport function for bile acids.The first evidence for this theory was the connection between SLC10A5 and the nuclear bile acid receptor FXR, which is the main regulatory protein of the bile acid homeostasis. A transport function of SLC10A5 for bile acids has not been shown yet. In the present work a transport function was investigated with two different methods, a chimera of SLC10A5 and the c-terminal end of NTCP localized in the plasma membrane as well as membrane-vesicles made by ultracentrifugation of stably transfected SLC10A5 cells. Neither method showed a transport of the tested bile acids by SLC10A5.The second part of deorphanizing SLC10A5 was finding the subcellular localization of the protein. Previous experiments and dissertations already indicated a strict intracellular expression pattern, contradicting the plasma membrane localization of described members of the SLC10 family. The intracellular expression pattern was confirmed by fluorescent staining of mice liver and kidney tissue with a custom-made antibody, directed against the c-terminus of SLC10A5. The specificity of this antibody was verified by the absence of a fluorescent signal in the tissue of Slc10a5-/- knockout-mice. To investigate the subcellular localization of SLC10A5, the protein was colocalized with fluorescent cell-organelle markers via live-cell-imaging. In these experiments the biggest overlaps of the signals were seen in the endo- lysosomal compartments and the ER, although the colocalization of SLC10A5 in the endo- lysosomal compartment was mainly based on the protein s physicochemical properties and the effects of in vitro protein-overexpression and degradation. Taken together, the results of preceding thesis and the intracellular bile acid metabolism lead in this dissertation to the conclusion that SLC10A5 is localized in the ER.On the basis of the Slc10a5-/- knockout-mouse pilot study by Aretz (2015), which showed a massive impact of SLC10A5 on the detoxification of the cholate-overloaded enterohepatic circulation, the function of SLC10A5 under normal feeding- and environmental conditions was investigated in the present work. The results indicated that taurodeoxycholic acid and taurohyodeoxycholic acid levels were elevated in the bile, and the unconjugated forms of these bile acids were elevated in the feces of male Slc10a5-/- knockout-mice under standard conditions. Additionally, serum levels of deoxycholic acid were increasd. Comparable observations in female Slc10a5-/- knockout-mice could not be observed. In male Slc10a5-/- knockout-mice this leads to the possibility of SLC10A5 as a co-factor in rehydroxylation of secondary bile acids in the liver ER. An impact of the gene-knockout on energy expenditure could not be observed. The differences in the calculated hydrophobicity indices of bile, serum and feces detected in the present work show a direct influence on the physiological balance of the bile acid metabolism of mice and lead to a variety of potential assays and methods to further investigate SLC10A5.