Nachweis und DNA-Fingerprinting von Escherichia coli O157-Stämmen bei Pferden

Abstract

Wiederkäuer gelten als Hauptreservoir der verotoxinogenen Escherichia coli (VTEC). Die als potentiell hochvirulent einzustufenden Serovare O157:H7 und O157:H- werden in Deutschland jedoch nur selten bei landwirtschaftlichen Nutztieren nachgewiesen. In geringerem Umfang können VTEC auch bei anderen Haus- und Wildtierspezies isoliert werden. In der Literatur finden sich Berichte über den Nachweis von E. coli O157 bei Pferden, die in Zusammenhang mit humanen Erkrankungsfällen standen. In Bayern wurde ein Sorbit-fermentierender (SF) E. coli O157:H--Stamm bei Minipferden isoliert, die als Infektionsquelle für ein an hämolytisch-urämischem Syndrom (HUS) erkranktes Kind vermutet wurden. Bislang konnte das Reservoir dieser offenbar hochvirulenten SF E. coli O157:H--Stämme noch nicht identifiziert werden; bei Wiederkäuern gelang der Nachweis solcher Stämme nur vereinzelt. Aufgrund biochemischer Unterschiede wird dieser Klon von den für E. coli O157:H7 gebräuchlichen kulturellen Verfahren nicht erfaßt. In der vorliegenden Arbeit sollte nun das Vorkommen von E. coli der Serogruppe O157 unter besonderer Berücksichtigung der SF E. coli O157:H--Stämme bei Pferden untersucht werden. In die eigenen Untersuchungen wurden 100 Pferdekotproben einbezogen. Zur Optimierung der Nachweismethodik wurden die ersten 51 Proben vergleichend in zwei Selektivanreicherungen (modifizierte Trypton-Soja-Bouillon [mTSB] und gram negative broth [GN] nach HAJNA) in Kombination mit der immunomagnetischen Separation (IMS), sowie im Direktausstrich ohne IMS untersucht. Die Subkultivierung erfolgte in allen Ansätzen auf Hemorrhagic Colitis-Agar nach SZABO (HC), da dieser auch das Wachstum Tellurit-sensitiver Organismen wie SF E. coli O157:H--Isolate erlaubt. Um letztere mitzuerfassen, wurden nach Subkultivierung zusätzlich zu den jeweils zehn Sorbit-negativen Kolonien auch zehn Sorbit-positive Kolonien mit einem kommerziell erhältlichen E. coli O157-Latex-Test überprüft. Da mit der Kombination mTSB-Bouillon und IMS 94,1 % aller insgesamt E. coli O157-positiven Proben erfaßt werden konnten, wurde diese Untersuchungsvariante für die nachfolgenden 49 Fäzesproben ausschließlich eingesetzt. Präsumtive E. coli O157-Isolate wurden nach biochemischer Bestätigung mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf Verotoxin- und eae-Gen(e) untersucht. Bei einer repräsentativen Auswahl an Isolaten wurde weiterhin die Serogruppenzugehörigkeit durch PCR bestätigt, das für das H-Antigen codierende fliC-Gen mit Hilfe eines Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus-Tests (RFLP) charakterisiert, sowie die Fähigkeit zur Hämolyse überprüft. Weiterhin wurde der Grad der genetischen Verwandtschaft der Isolate untereinander sowie im Vergleich zu zwei Referenzstämmen mittels Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) untersucht.In 61 Proben (61%) konnten mit O157-Antiserum agglutinierende Kolonien nachgewiesen und genotypisch bestätigt werden. Von insgesamt 329 Isolaten zeigten 205 Sorbit-Fermentierung (62,3%), 124 waren Sorbit-negativ (37,7%). Alle zeigten auf HC-Agar Fluoreszenz. 24 Isolate (7,3%) waren Indol-negativ und biochemisch nicht eindeutig als E. coli zu identifizieren. Bei keinem der Isolate konnte das eae-Gen oder Verotoxin-Gene detektiert werden; ebenso war keine Hämolyse zu beobachten. Die Restriktionsmuster waren nicht mit dem von O157:H7-Stämmen identisch. In der PFGE zeigten die 92 untersuchten Isolate 53 verschiedene Restriktionsmuster, die sich zu acht Clustern zusammenfassen ließen. Die zwei einbezogenen Referenzstämme, ein O157:H7-Isolat sowie ein von den o. e. Minipferden gewonnenes SF VTEC O157:H--Isolat, konnten jedoch keinem Cluster zugeordnet werden. Nach diesen Untersuchungen stellen Pferde kein Reservoir für verotoxinogene E. coli O157:H7/H- dar. Auffallend ist jedoch das regelmäßige Auftreten von Verotoxin-negativen Isolaten dieser Serogruppe. Das Vorkommen solcher Isolate wurde in der Literatur bereits bei einer Vielzahl unterschiedlicher Probenarten beschrieben, wenngleich nicht mit der hier gefundenen Häufigkeit. Bei Untersuchungsmethoden, die lediglich auf dem Nachweis der Serogruppe O157 beruhen, ist also bei der Interpretation eines positiven Befundes Vorsicht geboten. Ohne weitergehende Untersuchungen zum Pathogenitätspotential läßt sich daraus noch keine Bedeutung als möglicher Krankheitserreger ableiten. Diese Ergebnisse unterstützen die Forderung nach Serovar-unabhängigen VTEC-Nachweismethoden. Ruminants are regarded as the main reservoir of verocytotoxigenic Escherichia coli (VTEC). The serotypes O157:H7 and O157:H-, which must be considered potentially highly virulent, are rarely detected in German livestock. To a lesser extent, VTEC can also be isolated from companion animals and wildlife. There are reports about the detection of E. coli O157 in horses, which were connected with illness in humans. In Bavaria, a sorbitol-fermenting (SF) E. coli O157:H--strain was isolated from ponies, which were considered to be the source of infection for a child suffering from hemolytic uremic syndrome (HUS). Up to now, the reservoir of these obviously highly virulent SF E. coli O157:H--strains could not be identified. They could only occasionally be found in ruminants. Because of biochemical differences, this clone cannot be detected by the cultural methods usually applied for E. coli O157:H7. In this work, the occurrence of E. coli O157 in horses, with special emphasis on SF E. coli O157:H-, was investigated. Investigations included 100 equine fecal samples. To optimize the detection method, the first 51 samples were examined with two different selective enrichment media (modified tryptic soy broth [mTSB] and gram negative broth [GN] according to HAJNA), both combined with the immunomagnetic separation technique (IMS), and additionally by direct plating without IMS. Subcultivation was performed in all cases on hemorrhagic colitis-agar according to SZABO (HC), because this medium allows growth of tellurite-sensitive organisms like SF E. coli O157:H--isolates. To include the latter, ten sorbitol-positive colonies were tested with a commercially available E. coli O157 latex test kit after subcultivation, in addition to ten sorbitol-negative colonies, respectively. Because 94,1 % of all E. coli O157-positive samples could be detected by the combination of mTSB and IMS, this method was solely applied to the following 49 fecal samples. After biochemical confirmation, presumptive E. coli O157-isolates were tested for verocytotoxin- and eae-gene(s) by polymerase-chain-reaction (PCR). A representative subset of strains, including at least one strain of each positive sample, was further examined. The serogroup was confirmed by PCR, the fliC-gene, coding for the H-antigen, was characterized by restriction fragment length polymorphism (RFLP), and the ability for hemolysis was tested. Additionally, the degree of genetic relatedness among the isolates themselves and in comparison with two reference strains was examined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).In 61 samples (61 %), colonies could be found which showed agglutination with O157-antiserum and were confirmed genotypically. Of a total of 329 isolates, 205 isolates showed sorbitol-fermentation (62,3 %), 124 were sorbitol-negative (37,7 %). All showed fluorescence on HC-agar. 24 isolates (7,3 %) were indole-negative and could not definitely be identified as E. coli by biochemical reactions. The eae-gene or verocytotoxin-genes was not detected in any isolate; hemolysis was not observed either. The restriction patterns were not identical with that of O157:H7-strains. The 92 strains showed 53 different PFGE-restriction patterns, which could be grouped in eight clusters. According to these results, horses cannot be regarded as a significant reservoir for verocytotoxigenic E. coli O157:H7/H-. However, the regular occurrence of verocytotoxin-negative isolates of this serogroup is remarkable. The detection of such isolates has been described in the literature for a multitude of different matrices, though not with the frequency found in this work. Positive results of examination methods, which only rely on the detection of serogroup O157, must be interpreted with care. A significance as potential pathogen cannot be deduced without further examinations of the virulence profile. These results support the demand for serotype-independent detection methods for VTEC.