The nuclear localization signal of Hepatitis B Virus Core Protein : characterization by expression as EGFP-Core Fusion Protein

Abstract

HBV core particles are involved in a number of important functions in the replication cycle of HBV. Nuclear import studies of cellular protein showed that HBV capsid binds to the nuclear pore complex, following the classical pathway of karyophilic proteins, which is mediated by the cellular proteins importin alpha and beta. The transport of the capsid into the nucleus is facilitated by a nuclear localization signal that is located within the carboxyl terminal domain between amino acid 158 and 168 of the core protein. Unlike the NLS consensus sequence, HBV core NLS does not comprise a lysine residue, leading to the assumption that the NLS shows only weak interaction with importin alpha. The understanding of the NLS and its nuclear transport receptor interaction is mainly based on observations using biochemical assays like co-immune precipitation and in vitro transport assays. This study was intended to provide corresponding in vivo evidence. By expressing fusion proteins of core and fluorescent marker protein, the strength of core NLS and the impact of phosphorylation was investigated. To analyze the intracellular localization of HBV capsid in human liver cells, firstly the entire HBV genome was transfected into HuH-7 cells. The HBV capsid was found to be localized predominantly in the nucleus as it is in vivo. EGFP was chosen as a fluorescent marker protein to generate fusion protein with HBV core. The fusion protein was shown to form at least dimers but failed to assemble to capsids. This fusion protein was imported into the nucleus, redundancy of the HBV core NLS increased the translocation. Moreover the replacement of the theoretically weak HBV core NLS by the NLS of the SV40 Tag led to a similar transport competence.The nuclear import was dependent upon phosphorylation as shown by Staurosporine treatment of transfected cells. The different fusion proteins used in these assays showed that serine 141 is the key amino acid that has to be phosphorylated. This phosphorylation however seems to differ in different cell lines and was apparently affected by the growth conditions of the cells. It must be thus concluded that there is a complex phosphorylation pattern of the core protein that affects different steps in the viral life cycle including nuclear transport. The coordination of these different phosphorylation steps remains to be elucidated. HBV Core-Partikel sind an einer Reihe wichtiger Funktionen im viralen Replikationszyklus beteiligt. Kernimportstudien mit zellulären Proteinen haben gezeigt, dass HBV-Kapside, dem klassischen Importweg karyophiler Proteine folgend, an den Kernporenkomplex binden. Dieser nukleäre Transport wird durch Importin alpha und beta vermittelt. Der Kernimport der Kapside wird durch ein Kernlokalisationssignal, welches in der carboxyterminalen Domäne zwischen den Aminosäuren 158 und 168 des Core- Proteins lokalisiert ist, erleichtert. Das Kernimportsignal des HBV Core-Proteins enthält im Gegensatz zu der Konsensussequenz des NLS keinen Lysinrest, was zu der Annahme führte, dass nur eine schwache Interaktion zwischen dem NLS und Importin alpha eingegangen wird. Das Verständnis über das Kernlokalisationssignal und die Interaktion mit dessen Transportrezeptor basiert hauptsächlich auf Ergebnissen von biochemischen Versuchen, wie Koimmunpräzipitationen und in vitro Transportstudien. In dieser Arbeit sollten entsprechende in vivo- Beweise gefunden werden. Durch die Expression von Fusionsproteinen, bestehend aus dem Core- und einem fluoreszierenden Markerprotein, sollten die Stärke des Core-NLS und der Einfluss der Phosphorylierung untersucht werden. Zur Analyse der intrazellulären Lokalisation von HBV-Kapsiden in menschlichen Leberzellen wurden HuH-7 Zellen zunächst mit dem gesamten Genom des Hepatitis B Virus transfiziert. Wie auch im lebenden Organismus waren die HBV-Kapside überwiegend im Nukleus lokalisiert. Für die Generierung eines HBV-Core-Fusionsproteins wurde EGFP als Markerprotein verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Fusionsprotein in der Lage ist, Dimere zu bilden, ein Assembly zu Kapsiden jedoch ausblieb. Das Fusionsprotein wurde in den Zellkern importiert, wobei die Redundanz der HBV-Core NLS die Translokation erhöhte. Darüber hinaus zeigte der Austausch des theoretisch schwachen Core-NLS gegen das Kernlokalisationssignal des SV40 Tag eine ähnliche Transportkompetenz.Durch die Behandlung von transfizierten Zellen mit Staurosporine konnte gezeigt werden, dass der nukleäre Import von der Phosphorylierung abhängig ist. Untersuchungen mit unterschiedlichen Fusionsproteinen weisen darauf hin, dass es sich bei Serin 141 um eine besondere wichtige Aminosäure handelt, welche phosphoryliert werden muss. Diese Phosphorylierung scheint sich in verschiedenen Zelllinien zu unterscheiden und offenbar durch die Wachstumsbedingungen der Zellen beeinflusst zu werden. Die vorliegenden Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass das Core-Protein ein komplexes Phosphorylierungsmuster aufweist, welches im viralen Lebenszyklus unterschiedliche Schritte, inklusive nukleärer Transport, beeinflusst. Die Aufklärung der Koordination dieser unterschiedlichen Phosphorylierungen bleibt zukünftigen Studien vorbehalten.