Blutzellzählung und -differenzierung bei Pferd und Schwein mit dem Hämatologiesystem ADVIA 120 : Gerätevalidierung und Softwareadaptation

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Erstellung einer geeigneten Multi-Spezies-Software für das Hämatologiesystem ADVIA 120 und die Evaluierung für die Tierarten Pferd und Schwein. Zur Prüfung der Tauglichkeit des ADVIA 120 für den Messeinsatz an Pferde- und Schweineblut, wurde nach vorliegendem Protokoll der Nationalen Zulassungsbehörde (FDA, USA) in enger Anlehnung an die ICSH-Richtlinen:

eine Präzision über verschiedene Serien hinweg und eine Präzision innerhalb der Serie durchgeführt. Für die Parameter WBC, RBC und die Erythrozytenindizes konnte in der vierten Softwareversion eine extrem geringe Variabilität (CV < 1,9%) für beide untersuchten Tierarten ermittelt werden. Die Thrombozytenzählung ergab Variationskoeffizienten von CV = 3,6% (Pferd) und 4,6% (Schwein) und lag hier deutlich unter denen in der Literatur angegebenen Grenzwerte. Die Variabilität der Retikulozytenzählung blieb bei Schweineblut mit Werten zwischen CV = 5,6% und 9,1% in einem sehr guten Bereich. Pferderetikulozyten wurden gefunden, waren jedoch wegen des geringen Aufkommens durch eine hohe Streubreite gekennzeichnet. Eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse lässt sich ebenfalls für das Differenzialblutbild feststellen. Die in hoher Zellzahl vorkommenden neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten können mit dem ADVIA 120 mit einer erfreulich geringen Varianz bestimmt werden. Werte von CV = 1,3% bis 2,5% liegen auch hier deutlich unter den Angaben aus der Literatur. Monozyten zeigen mit 10% (Pferd) und 15% (Schwein) eine vergleichsweise geringe Variabilität. Eosinophile und basophile Granulozyten des Schweins liegen bei CV < 11%, während hier für Pferdeblut höhere Varationskoeffizienten (CV = 11 - 16%) ermittelt werden. Die anhand von 25-fach Messungen ermittelte Präzision innerhalb der Serie erbrachte erwartungsgemäß ebenfalls ein sehr gutes Ergebnis. Mit Ausnahme des WBC beim Schwein (CV 3,4%) und der PLT- Zählung (Schwein CV = 2,9%, Pferd CV = 5,4%) lagen die CV-Werte z. T. deutlich unter 2%. Retikulozyten beim Schwein zeigen eine Streubreite von 7,8% bis 9,8%. die Richtigkeit der ADVIA 120 Messung anhand des Methodenvergleichs überprüft. Als Referenz- und Vergleichsgeräte bzw. -methoden dienten H1, Sysmex F-800, Mikrohämatokritzentrifuge, die manuelle Leukozytendifferenzierung mit 200 sowie die Retikulozytenzählung mit 1000 ausgezählten Zellen. Die Blutzelldifferenzierung erfolgte mittels panoptisch gefärbter Blutausstriche nach Pappenheim, den zytochemischen Färbungen Peroxidase und Alphy-Naphtyl-Acetat-Esterase und einer Supravitalfärbung mit Brilliantkresylblau für die Retikulozytenzählung. Vergleichsmessungen des ADVIA 120 mit dem H1 ergaben sehr gute bis exzellente Korrelationen. Herausragend vor allem WBC, RBC, MCV des Pferdes und RBC des Schweines mit Werten von r > 0,99. Für Thrombozyten lagen die Werte bei r = 0,973 (Pferd) und r = 0,955 (Schwein). Die Korrelationen des ADVIA 120 mit dem Sysmex F-800 lagen insgesamt niedriger, für WBC, RBC und HGB mit r > 0,95 aber immer noch in einem sehr guten Bereich. Die Messergebnisse der Thrombozytenzählung hingegen unterstreichen mit r = 0,289 (Pferd) und r = 0525 (Schwein) deutlich die Unterschiede in der Messtechnologie. Mit seiner neuen zweidimensionalen, erweiterten Thrombozytenanalyse, ist der ADVIA 120 dem Impedanzverfahren (F-800) deutlich überlegen. Retikulozyten wurden bei beiden Tierarten gefunden. Sie korrelieren beim Schwein mit r = 0,489 mäßig, während bei Pferden keine Übereinstimmung vorhanden war. Im Differenzialblutbild konnte für neutrophile Granulozyten und Lymphozyten beider Tierarten ein hochsignifikanter Zusammenhang der Ergebnisse ermittelt werden. Beste Übereinstimmung zeigte Schweineblut (r = 0,974) für den Vergleich ADVIA 120 / panoptische Färbung. Eosinophile Granulozyten des Schweines korrelierten in allen drei Färbungen (r = 0,863 - 0,93) besser als die des Pferdes. Für Monozyten konnten nur geringe r = 0,391 (Pferd) bzw. keine (Schwein) Übereinstimmungen erreicht werden. Linearität und Verschleppung in unterschiedlichen Messbereichen getestet. Die bei der Linearitätsprüfung ermittelten Korrelationen erwiesen sich als hervorragend. Sie lagen für die untersuchten Parameter Erythrozytenzahl (RBC 0,00 bis 12,43 1012/l), Hämoglobin (HGB 0,00 bis 14,1 mmol/l), die Gesamtleukozytenzahl (WBC 0,00 bis 107,88 x 109/l) und Thrombozyten (PLT 64 bis 961 x 109/l) zwischen r = 0,98 und 1,00. Die Werte für den Grad der Verschleppung (carry over) liegen für die dargestellten Parameter RBC, HGB, WBC und PLT zwischen 0,00 und 0,29 %. ein Vergleich der am meisten verwendeten Antikoagulanzien durchgeführt.Im Vergleich der Antikoagulanzien K3EDTA, Li-Heparin und Na-Citrat konnten signifikante Veränderungen bezüglich der Thrombozytenparameter in Li-Heparinblut nachgewiesen werden. Am besten geeignet zur Blutanalyse am ADVIA 120 ist der Gerinnungshemmer K3EDTA. der Einfluss von Lagerungstemperatur und -dauer ermittelt.In Verlaufsuntersuchungen über 72 Stunden wurde die Stabilität von Pferde- und Schweineblut sowie das Messverhalten des ADVIA 120 während der Probenalterung in Abhängigkeit von der Lagerungstemperatur überprüft. Da der ADVIA 120 vor allem Einsatz im Großlabor findet, spielt der Einfluss von Zeitraum und Art der Lagerung auf die Blutparameter eine entscheidende Rolle bei deren Beurteilung. Pferdeblut erweist sich als relativ temperaturunabhängig, während die Blutparameter des Schweines signifikante Abweichungen zeigen. Bei Untersuchung der Thrombozyten des Pferdes spielt die Lagerungstemperatur in den ersten 24 Stunden keine Rolle. Eine Retikulozytenbestimmung sollte innerhalb von 3 Stunden nach Blutentnahme erfolgen, da die Retikulozytenparameter deutliche Abhängigkeit von der Lagerungsart zeigen. Im Ergebnis sollte Schweineblut immer sofort gekühlt werden. Pferdeblut hingegen nur, wenn die Untersuchung voraussichtlich mehr als 24 Stunden nach Blutentnahme durchgeführt wird. die Ausgabe der grapischen Darstellungen mittels Fallbeispielen beurteilt.Anhand von ausgewählten Beispielen wurden die Vorteile der graphischen Darstellung aufgezeigt. Hierbei wird die Beurteilung der Messergebnisse in Form von Zytogrammen besonders bei Proben mit pathologischen Veränderungen extrem erleichtert. Schnelles Erkennen von abnormem Zellaufkommen (quantitativ und qualitativ) oder abweichender Zellmorphologie stellt in der automatisierten Labordiagnostik ein unabdingbares Hilfsmittel zur Diagnosefindung und Qualitätssicherung dar. Das Hämatologiesystem ADVIA 120 ist mit seiner Multi-Spezies-Software für die Tierarten Pferd und Schwein in der klinischen Labordiagnostik sehr gut einsetzbar. Grenzen liegen hier lediglich bei der Beurteilung der Monozytendiagnostik. Ansonsten misst der ADVIA 120 mit größter Genauigkeit und ermittelt verlässliche Ergebnisse bei Zellzählung und -differenzierung.

The aim of this study was to generate suitable multi-species software for the haematology system ADVIA 120 and to evaluate it with respect to horses and pigs. In accordance with the current protocol of the national authorisation authority (FDA, USA) and in close compliance with the ICSH guidelines, the following procedures were taken in order to assess the suitability of the ADVIA 120 for measuring and analysing horse s and pig s blood:

A precision study across different batches and a precision study within the batch were carried out. For the parameters WBC, RBC and the erythrocyte indices, the variability was found to be extremely low (CV < 1.9%) in the fourth software version for both animal species under examination. The thrombocyte count showed coefficients of variation of CV = 3.6% (horses) and 4.6% (pigs) and, as such, was clearly below the threshold values stated in the literature. With values ranging from 5.6% to 9.1% in pig s blood, the variability of the reticulocyte count was very good. Reticulocytes were found in horses but the measured values were widely spread on account of their low occurrence. Similarly, a very high level of reproducibility of the results was noted for the differential blood count. Occurring in a high number of cells, the neutrophile granulocytes and lymphocytes can be identified using the ADVIA 120 with a gratifyingly low variance. Values of CV = 1.3% to 2.5% are also well under the values given in the literature. At 10% (horses) and 15% (pigs), monocytes show comparably low variability. Eosinophile and basophile granulocytes levels in pigs are at CV < 11% while higher coefficients of variation can be determined in this case for horse s blood (CV = 11 - 16%). The precision within the batch, calculated over 25 measurements, also yielded very good results as expected. With the exception of the WBC in pigs (CV 3.4%) and the PLT count (pigs CV = 2.9%, horses CV = 5.4%) some of the CV values were well below 2%. Reticulocytes in pigs show a spread of 7.8 to 9.8%. The accuracy of the ADVIA 120 measurement was tested by method comparisons. The following served as reference and comparison equipment or methods: H1, Sysmex F-800, microhaematocrit centrifuges, manual leukocyte differentiation as determined by counting 200 cells and the reticulocyte count as determined by counting 1000 cells. The blood cell differentiation was effected by means of panoptic staining of blood smears following the Pappenheim method, the cytochemical dyes peroxidase and alpha-naphthyl-acetate-esterase and supravital staining with brilliant cresyl blue for the reticulocyte count. A comparison of the measurements made by the ADVIA 120 with those made by the H1 showed very good to excellent correlations. Particularly outstanding were the WBC, RBC and MCV in horses and RBC in pigs with values of r < 0.99. For thrombocytes the values were r = 0.973 (horses) and r = 0.955 (pigs). The correlations of the ADVIA 120 with the Sysmex F-800 were lower overall, at r < 0.95 for WBC, RBC and HGB, but nevertheless still in a very good range. At r = 0.289 (horses) and r = 0525 (pigs), on the other hand, the thrombocyte count readings clearly underline the differences in the measurement technology. With its new two-dimensional advanced platelet analysis the ADVIA 120 is clearly superior to the impedance method (F-800). Reticulocytes were found in both animal species. At r = 0.489, they correlate moderately in the case of pigs whereas no correlation was found in the case of horses. A highly significant correlation of the results was determinable in the differential blood count for neutrophile granulocytes and lymphocytes in both species. The best correlation was showed by pig s blood (r = 0.974) for the ADVIA 120 / panoptic staining comparison. Eosinophile granulocytes in pigs correlated better than those of the horses in all three stainings (r = 0.863 - 0.93). In the case of monocytes, only a low correlation of r = 0.391 or nil (pigs) could be achieved. Linearity and carry-over were tested in different measurement ranges. The correlations determined during the linearity test proved to be outstanding. They were between r = 0.98 and 1.00 for the following parameters investigated: erythrocyte count (RBC 0.00 to 12.43 1012/l), haemoglobin (HGB 0.00 to 14.1 mmol/l), the overall leukocyte count (WBC 0.00 to 107.88 x 109/l) and thrombocytes (PLT 64 to 961 x 109/l). The values for the degree of carry-over are between 0.00 and 0.29 % for the reported parameters RBC, HGB, WBC and PLT. A comparison of the most frequently used anticoagulants was carried out. In a comparison of the anticoagulants K3EDTA, Li-heparin and sodium citrate, evidence was found of significant changes to the thrombocyte parameters in Li-heparin blood. The anticoagulant K3EDTA is the most suitable one for blood analysis with the ADVIA 120. The influence of storage temperature and storage duration was evaluated.In investigations carried out over a period of 72 hours the stability of horse s and pig s blood and the analysis response of the ADVIA 120 were monitored as the sample aged and deteriorated depending on the storage temperature. Since the ADVIA 120 is primarily used in large laboratories, the influence of the duration and type of storage on the blood parameters plays a crucial role in its assessment. Horse s blood is shown to be relatively unaffected by temperature factors whereas the blood parameters of pigs show significant deviations. When investigating the thrombocytes of horses, the storage temperature in the first 24 hours makes no difference. A reticulocyte reading should be taken within three hours of taking the blood sample since the reticulocyte parameters are clearly affected by the method of storage. The results show that pig s blood should always be refrigerated immediately whereas horse s blood need only be refrigerated if the investigation is likely to be carried out more than 24 hours after taking the blood sample. The readout of graphical representations was assessed by way of case examples. The advantages of graphical representations were highlighted using selected examples, whereby the analysis of the readings is made significantly easier in the form of cytograms, especially in the case of samples with pathological changes. Rapid detection of abnormal amounts of cells (quantitative and qualitative) or differences in cell morphology constitute an essential resource for diagnosis and quality assurance in automated laboratory diagnosis. With its multi-species software, the ADVIA 120 haematology system is highly suitable for use in clinical laboratory diagnostics for horses and pigs. Its only limitation is in monocyte diagnosis. In all other respects the ADVIA 120 is a measurement instrument of supreme precision with the ability to calculate reliable results in cell counts and cell differentiation.