Die Bedeutung von TRPC-Kanälen in der Muskarin-vermittelten Kontrolle peripherer Atemwege der Maus

Abstract

Der wichtigste neurogene Bronchokonstriktor Acetylcholin (ACh) reagiert in der Lunge mit Subtypen muskarinischer Acetylcholinrezeptoren (mAChR), die auf glatten Muskelzellen und Epithelzellen lokalisiert sind. Bislang lagen v. a. Erkenntnisse über den Effekt und die Signaltransduktionswege nach mAChR-Stimulation an zentralen Atemwegen wie Trachea und Stammbronchien vor. Wegen ihrer besonderen Bedeutung bei der Pathogenese obstruktiver Lungenerkrankungen wurden in dieser Arbeit die für den Atemwegswiderstand wichtigeren peripheren Atemwege näher untersucht. Anhand von vitalen Schnittpräparationen von Lungen konnten mAChR-Subtypen peripherer Atemwege funktionell nachgewiesen werden. Die Muskarin-vermittelte Konstriktion peripherer Atemwege war durch eine schnelle und starke initiale Konstriktion gekennzeichnet, die über die gesamte Zeit der Anwesenheit des Agonisten andauernd war. Die nähere Untersuchung der beteiligten Signalwege ergab, dass das für die Konstriktion erforderliche Kalzium initial aus intrazellulären Kalziumresourcen stammt. Zur Aufrechterhaltung der Konstriktion bedarf es wie in zentralen Atemwegen des Einstroms von Kalzium aus dem Extrazellularraum. In weiteren Untersuchungen wurden die für den Kalziumeinstrom verantwortlichen Kanäle peripherer Atemwege näher untersucht. Eine Beteiligung von spezifischen spannungsabhängigen Kalziumkanälen (VOCCs) konnte mit Hilfe des Agonisten Verapamil ausgeschlossen werden. Dagegen erwiesen sich eine Gruppe von spannungsunabhängigen Kalziumkanälen (VICCs), die TRPC-Kanalproteine, als aussichtsreiche Kandidaten für den Kalziumeinstrom in die glatten Muskelzellen peripherer Atemwege. Von diesen waren TRPC1, TRPC3, TRPC4 und TRPC6 nicht nur auf transkriptioneller Ebene im Lungengewebe nachweisbar, sondern auch die Kanalproteine immunhistochemisch in Zellpopulationen peripherer Atemwege zu detektieren. Die Kanalproteine TRPC1, TRPC3 und TRPC4 konnten auf Epithelzellen und die strukturell und funktionell zu einer Untergruppe gehörenden Kanäle TRPC3 und TRPC6 auf glatten Muskelzellen der Bronchioli nachgewiesen werden. Bei letzteren ließ sich eine Aktivierung durch ein DAG-Analogon videomorphometrisch messen. Diese Experimente belegen erstmals eine Beteiligung von TRPC-Kanalproteinen am Kalziumeinstrom in einem organnahen Lungenmodell. Die nach mAChR-Stimulation aktivierten TRPC-Kanalproteine scheinen an der Konstriktion peripherer Atemwege und damit maßgeblich an der Pathogenese obstruktiver Lungenerkrankungen beteiligt zu sein. Durch eine Modulation von TRPC-Kanälen ergeben sich möglicherweise zukünftig neue Zielgebiete pharmakologischer Interventionen. In the lungs the most important neurogenic broncho-constrictor, acetylcholine (ACh), reacts with subtypes of muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) on smooth muscle cells and epithelial cells. Up to now there only existed data regarding the mAChR-mediated effects and signal transduction pathways in central airways (e. g. trachea and main bronchi). With respect to their special importance in the pathogenesis of obstructive pulmonary disease, the present work concentrates on the peripheral airways that appear to be highly important for airway-resistance. Experiments using vital lung-slice preparations gave a functional proof of the existence of mAChR in peripheral airways. The constriction of peripheral airways caused by muscarine induced a bisphasic concentration-dependent response, characterized by a strong initial constriction and a sustained constriction that lasted as long as the agonist was present. Additional experiments indicated that the initial constriction depends on intracellular calcium release. Subsequent investigations concentrated on the channels that are responsible for the calcium influx which is responsible for the sustained constriction in peripheral airways. By using the antagonist Verapamil the participation of specific, voltage operated calcium channels (VOCCs) was excluded. However, a group of voltage insensitive calcium channels (VICCs) the TRP channel proteins showed to be interesting candidates that might mediate the calcium influx into smooth muscle cells of peripheral airways. Out of these, TRPC1-, TRPC3-, TRPC4-, and TRPC6-proteins could be found on a transcriptional level in pulmonary tissue. Using immunhistochemistry, the existence of the channel proteins TRPC1, TRPC3 and TRPC4 could be demonstrated on epithelial cells, whereas TRPC3 and TRPC6 both structurally as well as functionally belonging to the same subgroup could be demonstrated on bronchiolar smooth muscle cells. The activation of the latter by the diacylglycerol analogon OAG and blockade of TRPC-channels by SKF 96365 could be measured by videomorphometry. These experiments show - for the first time in an ex-vivo-lung-model - the participation of TRPC channel proteins on the mAChR-mediated constriction of peripheral airways. Given the important role of muscarinic cholinergic mechanism in pulmonary disease, these findings should be of considerable therapeutic relevance.