Untersuchungen zur immunmodulierenden Wirkung des Virulenzfaktors 'Intimin' von enteropathogenen und enterohämorrhagischen Escherichia coli beim Rind

Abstract

In der vorliegenden Arbeit sollten die für die Rezeptorbindung verantwortlichen, die C-terminalen 280 Aminosäuren umfassenden Fragmente der Intimine beta und gamma von STEC auf ihr Bindungsvermögen an bovine Lymphozyten hin untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden die Fragmente als Fusionsproteine mit Maltose-bindendem Protein (MBP) rekombinant hergestellt und affinitätschromatographisch gereinigt. Über durchflusszytometrische und fluoreszenzmikroskopische Bindungsstudien hinaus wurden funktionelle Untersuchungen mit mitogen-stimulierten Lymphozyten durchgeführt. Dazu wurde das Proliferationsverhalten während der Inkubation der Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit der Intimin-Fragmente durchflusszytometrisch untersucht. Die reverse Realtime-PCR diente zur Quantifizierung der Transkription ausgewählter Zytokine der TH1- und TH2-Immunreaktion. Um die Bedeutung der gewonnenen Erkenntnisse für die mukosale Immunantwort beurteilen zu können, wurden die Untersuchungen sowohl mit peripheren (PBMC) als auch mit intraepithelialen Lymphozyten aus dem Ileum (iIEL) durchgeführt. Vergleichsexperimente bestätigten, dass die gewonnenen Fusionsproteine in der Lage waren an HeLa-Zellen zu binden. Selbst unter Verwendung verschiedener Nachweissysteme konnte eine Bindung der Intiminfragmente an bovine PBMC oder iIEL jedoch nicht nachgewiesen werden. Das Fehlen von Intiminrezeptoren auf bovinen Lymphozyten wurde auch durch die funktionellen Untersuchungen bestätigt. So beeinflussten die Intiminfragmente weder die Proliferation mitogen-stimulierter PBMC noch die Transkription der untersuchten Zytokin-Gene.Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass bovine Lymphozyten gegenüber einer kostimulatorischen Aktivität von Intiminen anerg sind. Dies stellt einen weiteren Schritt zum Verständnis der molekularen Mechanismen dar, mit denen STEC die Darmschleimhaut von Rindern persistent kolonisieren können. Ruminants -especially adult cattle- are asymptomatically and persistently infected by Shigatoxin producing Escherichia coli (STEC) that colonize the intestine in commensal-like fashion. An important prerequisite for persistent infections may be a lack of inflammatory reactions of the host organism. During the process of colonization, bacterial intimins cause a tight adhesion between the pathogen and the epithelial cell. In mice, intimins also act as a costimulus and induce an inflammation of the TH1 type during T-cell activation. Thus, the persistent type of STEC induced infection in cattle may be related to the intimin´s failure to act as costimulus. Therefore, the aim of this investigation was to elucidate the binding capacity of the COOH-terminal 280 amino acids that represent the intimin-receptor-binding domain on eukaryotic cells. Recombinant engineering was performed in order to construct a fusion protein consisting of a maltose binding protein (MBP) and the 280 amino acids of the carboxy terminus of different intimin subtypes. FPLC served to purify the created fusion proteins. In addition to flow cytometry and fluorescence microscopy, functional assays with mitogen stimulated lymphocytes were accomplished. For this purpose, proliferation of the incubated cells in presence and absence of the intimin fragments was analyzed cytometrically. RT realtime-PCR was applied to quantify the transcription of certain cytokines of TH1- and TH2-type immune response. To properly interpret the achieved results concerning the mucosal immune response, experiments were done with bovine mononuclear cells of the peripheral blood as well as with intraepithelial cells extracted from the ileum (iIEL). It was shown that -in contrast to cells of bovine origin- the purified fusion proteins were able to bind to HeLa cells under the same conditions.Despite the use of different detection systems no proof of binding between the intimin fragments and bovine PBMC and IEL, respectively, could be given. Functional assays confirmed the lack of bovine lymphocyte intimin receptors as well. Therefore, the intimin fragments influenced neither the proliferating mitogen- stimulated PBMC nor the transcription of the evaluated cytokine genes. These results confirm the hypothesis of bovine lymphocytes being anergic to the costimulatory activity of intimins and thus presenting a further contribution to the understanding of molecular mechanisms responsible for persistent colonization of STEC on the bovine intestinal mucosa.