Molekularbiologische und biochemische Charakterisierung des equinen Thyroxin-bindenden Globulins

Abstract

Das TBG ist das wichtigste Transportprotein für Schilddrüsenhormone im Blut der meisten Säugetiere. Unter physiologischen Bedingungen sind mehr als 99% des im Blut zirkulierenden Thyroxins an Trägerproteine, in erster Linie an das TBG, gebunden. Es besitzt zum einen eine außergewöhnlich hohe Bindungsaffinität zu Thyroxin (T4) und Trijodthyronin (T3), zum anderen eine große Spezifität für diese Moleküle und ist daher zum Studium der komplexen Interaktion zwischen einem Transportprotein und seinem physiologischen Liganden hervorragend geeignet. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Serumkonzentration des Perissodactyla-TBG auf etwa 10-25% im Vergleich zum Menschen reduziert ist. Die Bindungsaffinität für T4 entspricht der des humanen, wohingegen eine vergleichbare Hitzestabilität nur bei 50°C festgestellt werden konnte. Bei Temperaturen über 50°C wurde eine deutliche Hitzeinstabilität des Perissodactyla-TBG gegenüber dem humanen nachgewiesen. TBG gehört aufgrund des hohen Grades der Homologie seiner DNA-Sequenz zu alpha1-Proteinaseinhibitor (alpha1 PI), alpha1-Antichymotrypsin und Cortisol-bindendem Globulin wie diese zur Superfamilie der Serpine. Die Struktur des TBG wird daher vom alpha1 PI abgeleitet. Eine exakte Charakterisierung der Eigenschaften des TBG würde die Aufklärung seiner Röntgenkristallstruktur erfordern, die bisher jedoch noch nicht gelang. Der Schlüssel zum genauen Verständnis der hochaffinen Bindung des TBG ist die Analyse seiner Primärstruktur, insbesondere im Bereich der Ligandenbindungsstelle. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde daher eine Sequenzierung des equinen TBG durchgeführt und diese anschließend mit anderen bereits sequenzierten Säugetier-TBGs verglichen. In der molekularbiologischen Analyse ergibt sich ein sehr hoher Homologiegrad zwischen equinem TBG, dem der bereits sequenzierten Säugetiere und dem Menschen. Das equine TBG weist wie auch das der Ratte und des Schweins eine zusätzliche Glykosilierungsstelle auf. Als dritter Aspekt der Arbeit wurde anhand der Sequenzdaten ein phylogenetischer Baum konstruiert, der die Verwandtschaft von Rind und Schaf (Artiodactyla) sowie von Beluga (Weißwal) und Delphin (Cetacea) und auch der Artiodactyla mit den Cetacea zeigt. Das Pferd und damit die Perissodactyla stellen erwartungsgemäß eine eigene Ordnung dar. Die molekulare Phylogenie ist eine Ergänzung der morphologischen Systematik. TBG is the most important transport protein for thyroid hormones in the blood of mammals. Under physiological conditions more than 99% of the circulating thyroxine are bound to transport-proteins, primarily to TBG. TBG has an exceptionally high binding affinity to T4 and T3 and a high specifity for these molecules. Therefore TBG is especially suited for the investigation of the complex interaction between a transport protein and its physiological ligand.In the present dissertation it was found that the serum concentration of TBG in Perissodactyla was reduced to about 10-25% of the human serum TBG concentration. The binding affinity of Perissodactyla TBG for T4 was comparable to human TBG. While the heat stability of Perissodactyla TBG was similar to human TBG at a temperature of 50°C, it was strongly reduced at temperatures above 50°C. Because of its high DNA sequence homology, TBG belongs to the superfamily of the serpins, like alpha1-proteinase inhibitor (alpha1-PI), alpha1-antichymotrypsin and cortisol binding globulin. For this reason the structure of TBG can be deduced from that of alpha1-PI. In order to characterize the properties of TBG the analysis of its cristall structure would be very helpfull, but unfortunately didn t succeed yet. The key for a correct understanding of the high binding affinity of TBG is the analysis of its primary structure, especially in the proximity of the ligand binding site. Therefore, in the second part of the dissertation, the sequence of equine TBG was obtained and compared to known mammalian TBG sequences. Alignment analysis revealed a very high level of homology of equine, human and the other mammalian TBGs. Equine TBG shows like TBG of the rat and the pig an additional glykosylation site. As a third aspect of this dissertation a phylogenetic tree was created by using sequential data which shows the relationship between cattle and sheep as well as between beluga (white whale) and dolphin and also between artiodactyla and cetacea. Horses and therefore perissodactyla represent an order of its own. Molecular phylogeny has to be considered as an addition to the morphologic systematic of mammals.