Untersuchungen zur Bedeutung des Fettsäuretransportproteins 4 (FATP4) : Sein Einfluss auf die Entstehung des Phänotyps von FATP4-defizienten Mäusen und Patienten mit letaler restriktiver Dermopathie

Abstract

Bislang ist über die zelluläre Aufnahme von Fettsäuren nur wenig bekannt. Man geht davon aus, dass es sich um ein Zusammenspiel von passiver Diffussion und aktivem Transport handelt. Der Familie der Fettsäuretransportproteine ( fatty acid transport proteins , FATP) wird dabei eine besondere Bedeutung beigemessen. Im Rahmen der gastroenterologischen Forschung galt das Hauptinteresse FATP4, welches als einziges der Transportproteine im Darm exprimiert wird. Um seine Bedeutung für den Fettsäurestoffwechsel auch in vivo zu untersuchen, wurde eine konstitutive Fatp4-Knockoutmaus hergestellt. Der Phänotyp dieser Maus wurde durch markante Hautveränderungen geprägt, die bereits Minuten bis Stunden nach der Geburt zum Tode führten und in bemerkenswerter Weise dem Erscheinungsbild der letalen restriktiven Dermopathie des Menschen ähnelten. Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, ob diese Hautveränderungen primär auf das Fehlen von Fatp4 in der Haut zurückzuführen sind, oder ob sie sekundäre Effekte der generalisierten Fatp4-Defizienz sind. Des Weiteren sollten im Rahmen der vorliegenden Dissertation die Vorraussetzungen für eine Sequenzierung der relevanten Regionen des humanen FATP4-Gens im Hinblick auf eine Klärung der Ätiologie der restriktiven Dermopathie geschaffen werden. Mit Hilfe konditionaler, epidermisspezifischer Fatp4-Knockoutmäuse sollten die Folgen einer auf die Epidermis beschränkten Inaktivierung des Fatp4-Gens bei adulten Tieren untersucht werden. Zur Herstellung dieser Tiere wurde auf das Cre/LoxP-Rekombinationssystem zurückgegriffen. Durch die Kreuzung von Fatp4 neo& #61508;ex3/flox -Mäusen mit Tieren, die Träger des K14-Cre-ERT2-Transgens sind, entstanden Mäuse, die einerseits ein durch LoxP-Sequenzen modifiziertes Fatp4-Allel (flox) enthielten und andererseits ein epidermisspezifisches induzierbares Transgen für eine Cre-Rekombinase (Cre) trugen. Unter die Kontrolle des hautspezifischen K14-Promotors (K14) gestellt, konnte die Expression der Cre-Rekombinase auf die Epidermis beschränkt werden. Die Induzierbarkeit wurde durch das Anfügen eines modifizierten Östrogenrezeptors (ER) erreicht, dessen Ligand das Östrogenanalogon Tamoxifen (T2) ist. Es erfolgte also erst nach Applikation von Tamoxifen eine Aktivierung der Cre-Rekombinase in der Haut und damit eine Inaktivierung des Fatp4-Gens. Nachdem zehn Wochen alte Mäuse (Fatp4neodeltaex3/floxK14-Cre-ERT2(tg/0)) über einen Zeitraum von sieben Wochen mit Tamoxifen behandelt worden waren, wurde die eine Hälfte der Tiere sieben und die andere Hälfte 13 Wochen nach der ersten Tamoxifenbehandlung getötet. Zunächst konnte gezeigt werden, dass ausschließlich in der Haut eine tamoxifeninduzierte Exzision der LoxP-flankierten Bereiche stattgefunden hatte. Die morphologischen und funktionellen Analysen der Haut ergaben eine Hyperproliferation und eine Hyperkeratinisierung der Epidermis sowie eine Reduktion der epidermalen Lipidbarrierefunktion. Diese Ergebnisse lassen tatsächlich auf eine essentielle Bedeutung von Fatp4 für die Bildung und Aufrechterhaltung der physiologischen Struktur und Barrierefunktion der Epidermis schließen. Ob eine Mutation des humanen FATP4-Gens für die Entstehung der letalen restriktiven Dermopathie verantwortlich ist, kann nun, nachdem die Methoden zur Sequenzierung der relevanten Bereiche etabliert wurden, geklärt werden. The mechanism of cellular fatty acid uptake is still poorly understood. Passive diffusion and carrier-mediated uptake are thought to operate in conjunction. The family of fatty acid transport proteins is considered to play an essential role in the overall process of cellular fatty acid uptake. Fatty acid transport protein 4 (Fatp4) is of particular interest, since it has been identified as the major intestinal Fatp. To analyze the functional significance of Fatp4 in vivo, a mouse line with targeted disruption of the Fatp4 gene was generated. Examinations of the resulting phenotype revealed marked alterations of the skin, which led to death shortly after birth and resembeled a human neonatally lethal restrictive dermopathy. Aim of the present study was to find out whether Fatp4 deficiency in the epidermis alone can cause changes in the epidermal structure or whether the observed abnormalities are secondary phenomena due to the loss of Fatp4 in another tissue or other tissues. Furthermore the prerequisites for sequencing all relevant parts of the human FATP4 gene were obtained in order to find out whether a mutation on the FATP4 gene is responsible for the origin of the lethal restrictive dermopathy. To evaluate the functional significance of Fatp4 in the epidermis, a mouse line with inducible Fatp4 deficiency in the skin was generated by using a conditional Cre/lox system. Crossing mice carrying the mutant allele Fatp4neodeltaex3/flox with transgenic mice expressing the K14-Cre-ERT2 transgene created double-mutant mice with a floxed Fatp4 allele (flox) and a transgene for an inducible epidermis-specific Cre recombinase (Cre). The expression of the Cre recombinase was directed by the K14 promotor, which is specifically active in the epidermis. Due to the fusion with a mutated ligand binding domain of the human estrogen receptor (ER) the activitiy of the Cre recombinase could be induced by the synthetic ligand tamoxifen. Not until tamoxifen administration conditional mutagenesis of Fatp4 was confined to the epidermis. At the age of ten weeks mice were treated with tamoxifen for five consecutive days, and again for five consecutive days, two, four and six weeks later. Animals were sacrificed 7 weeks or 13 weeks after the first tamoxifen treatment. First of all we found the tamoxifen-induced excision of exon 3 indeed to be restricted to the skin. Morphological and functional analysis of the Fatp4 deficient skin revealed a hyperproliferative hyperkeratosis with a disturbed epidermal barrier. These findings demonstrate that Fatp4 itself is essential for the formation and maintenance of a normal epidermal structure und barrier function. Having established the sequencing of all exons and exon-intron boundaries of the human FATP4 gene, investigations wether a mutation of this gene causes the lethal restrictive dermopathy can be started.