Untersuchungen zur genetischen Variabilität porciner Circoviren (PCV2) aus geimpften und ungeimpften Herden

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es mittels vergleichender Sequenzanalyse, Mutationen innerhalb der für Antigenität und Virusreplikation zuständigen Gene des PCV2-Genoms mit möglicher Assoziation zwischen PCV2-Genotyp, PCV2-Impfstatus und PCV2-Virusmenge in 62 PCV2-Sequenzen aus geimpften und nicht-geimpften Schweinebeständen aus Deutschland zu untersuchen. Als Ausgangsmaterial dienten PCV2-positive Proben, die im Rahmen des Schweinegesundheitsdienstes der Klinik für Wiederkäuer und Schweine, Professur Schweinekrankheiten, der Justus-Liebig-Universität, im Zeitraum 2008 bis 2012 gesammelt wurden. Anhand der beim Bestandsbesuch erstellten Anamnesebögen wurde eine Vorauswahl der Proben nach Herkunft aus geimpften und nicht-geimpften Beständen vorgenommen. 83,9 % der untersuchten 62 PCV2-Sequenzen entsprachen dem Genotyp PCV2b und 14,5 % dem Genotyp PCV2a. Die PCV2-Variante mPCV2b konnte nur ein einziges Mal unter den 62 Sequenzen nachgewiesen werden Die von den Genotypen realisierten PCV2-Erregermengen waren mit 103,6 für PCV2a und 105,5 für PCV2b signifikant (p=0,011) verschieden. Einiges spricht dafür, dass die PCV2-Impfung an der Verdrängung des Genotyps 2a durch 2b zumindest beteiligt sein könnte, da in den Proben der geimpften Bestände bis auf eine Ausnahme nur der Genotyp PCV2b vertreten war. Durch vergleichende Sequenzanalysen konnten Mutationen detektiert und Assoziationen zu PCV2-Virusmenge, PCV2-Genotyp und PCV2-Impfstatus hergestellt werden. Von insgesamt 47 SNPs im ORF2 mit Aminosäuresubstitution wiesen der SNP g.1566C>T (c.169G>A; p.57I>V) und der SNP g.1182G>T (c.553C>A; p.185L>M) eine signifikante Assoziation (p=0,005) zur PCV2-Virusmenge auf. Beide SNPs sind jeweils in immunogenen Bereichen des Kapsidproteins lokalisiert. Des Weiteren bestand eine signifikante Assoziation zwischen dem Aminosäureaustausch des SNP g.1182G>T und den PCV2-Genotypen (p < 0,001) sowie zum Impfstatus der 62 PCV2-Sequenzen (p = 0,03). In der vorliegenden Arbeit konnte anhand der 62 untersuchten PCV2-Sequenzen ein signifikanter Vorteil der PCV2b gegenüber den PCV2a-Sequenzen nachgewiesen werden. Obwohl die Sequenzen eine hohe Variabilität aufwiesen und somit keine spezifische Sequenz mit den Beobachtungen in Verbindung gebracht werden konnte. Ließ sich eine signifikant Korrelation einiger SNPs zu PCV2-Genotyp, PCV2-Impfstatus und PCV2-Virusmenge nachweisen. Von großer Relevanz hierbei war der im ORF2 lokalisierte SNP an Genomposition 1182 (g.1182G>T), welcher eine Aminosäuresubstitution innerhalb eines immunogenen Epitopes des Kapsidproteins veranlasste. Es wurde ein signifikanter Zusammenhang zwischen PCV2-Impfung und PCV2-Sequenz, PCV2-Genotyp und PCV2-Virusmenge aufgezeigt. The present study investigates hints of adaptation based on the analysis of sequence variation of PCV2 amplificates from vaccinated and non-vaccinated herds. 62 complete PCV2-sequences were obtained from the respective herds. Sequence data were substantiated by the quantification of sample viral loads. Sequences were compared to the PCV2 reference sequences of PCV2a (Acc. no. AF055392) and PCV2b (Acc. no. AF055394). Nine of the 62 PCV2 sequences belonged to genotype 2a (14.5%) and 53 to genotype 2b (83.9%). One of the PCV2b sequences was identified as mPCV2b (mutant PCV2b). Samples of the genotype 2b had significantly higher virus loads per µg DNA than samples representing genotype 2a (p = 0,011). With one exception, only genotype 2b was present on vaccinating herds, providing evidence for some association between vaccination and PCV2 genotype. There is some evidence that the PCV2 vaccination on the displacement of the genotype 2a through 2b may be at least involved because, with one exception only the genotype PCV2b was represented in the samples of vaccinated herds.Sequence analysis revealed correlations and associations of SNPs with PCV2 genotype, vaccination status and virus load. From a total of 47 SNPs in ORF2 leading to an amino acid substitution, the SNPs g.1566C> T (c.169G>A; p.57I>V) and g.1182G> T (c.553C > A, p.185L > M) showed significant associations with PCV2 virus load (p = 0.005). Both SNPs are located in the immunogenic regions of the capsid protein. The substitution of Leucine by Methionine at amino acid position 185 (p.185L > M; g.1182G>T) was significantly associated with PCV2 genotypes. All PCV2a sequences had the amino acid Methionine. Simultaneously the SNP at nucleotide position 1182 (g.1182G > T) was significantly associated with the status of vaccination (p = 0.03). Our data provide some evidence that PCV2 vaccination may select for PCV2 isolates with the amino acid Leucine at position 185 of the capsid protein.In conclusion, the comparison of 62 complete PCV2 sequences from vaccinated and non-vaccinated herds identified a significant decrease in PCV2a genotypes in favour of PCV2b. Sequences were highly variable and some SNPs showed a significantly association with genotype (2a vs. 2b), vaccination status and virus load. The most important SNP was located at nucleotide 1182 of PCV2 (g.1182G > T), leading to an amino acid substitution within one of the capsid epitopes. The results provide evidence for a selectional impact of vaccination on PCV2 sequence, PCV2 genotype and PCV2 load.