Untersuchungen zum Vorkommen und zur Bedeutung von Mykoplasmen bei Weißstörchen (Ciconia ciconia, LINNAEUS, 1758) und Beschreibung einer neuen Spezies (Mycoplasma ciconiae sp. nov.)

Abstract

Mykoplasmen sind zellwandlose Bakterien der Klasse Mollicutes, die als bedeutende Krankheitserreger beim Geflügel hohe wirtschaftliche Verluste verursachen. Bei Weißstörchen (Ciconia ciconia) gibt es vereinzelt Nachweise von Mykoplasmen bei geschwächt aufgefundenen Individuen. Über die Verbreitung von Mykoplasmen in der klinisch gesunden Weißstorchpopulation ist hingegen wenig bekannt. Diese Kenntnisse werden jedoch benötigt, um die klinische Bedeutung von Mykoplasmen für Weißstörche sowie Weißstörche als Erregerreservoir für geflügelpathogene Mykoplasmen, einschätzen zu können. In Voruntersuchungen an klinisch gesunden, wildlebenden Weißstorchnestlingen in Deutschland wurde eine flächendeckende Verbreitung von Mykoplasmen innerhalb der Storchenpopulation festgestellt (HAGEN et al. 2004). Eine Speziesdifferenzierung erfolgte nicht, dennoch wurden zwei Isolate (ST 57 und ST 101) identifiziert, die keiner bislang beschriebenen Spezies zugeordnet werden konnten. Ziel der Untersuchung war, diese beiden Isolate weiter zu charakterisieren, wenn möglich als Vertreter neu entdeckter Spezies zu beschreiben, und deren Vorkommen und Bedeutung bei Weißstörchen anhand der vorliegenden Proben zu eruieren. Für diese Arbeit standen 83 Mykoplasmenkulturen und eine DNA-Probe aus der Studie von HAGEN et al. (2004) zur Verfügung. Mit ausgewählten Isolaten wurden genetische und phänotypische Untersuchungen durchgeführt. Als Basis der phylogenetischen Untersuchungen dienten die Sequenzen des 16S-rRNA-Gens sowie der 16S-23S-Intergenic-Transcribed-Spacer-Region (ITS). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass das Isolat ST 101 sehr nah mit M. spumans und weiteren Mykoplasmenspezies verwandt war, sodass eine Beschreibung als neue Spezies nicht möglich war. Die biochemischen Eigenschaften der Isolate ST 57 und ST 101 wurden anhand der Fermentation von Glucose sowie der Hydrolyse von Arginin und Harnstoff untersucht. Von beiden Isolaten wurde zudem Temperaturoptimum und -toleranz für das Wachstum bestimmt. Beide Isolate wurden durch Membranfilter mit Porendurchmessern von 800 nm, 450 nm und 220 nm filtriert, um durch Passage der Filter indirekt das Fehlen einer Zellwand nachzuweisen. Desweiteren wurde eine Gramfärbung durchgeführt, um ebenfalls die Zellen sichtbar zu machen. Weitere Untersuchungen dienten der Beschreibung einer neuen Mykoplasmenspezies und wurden daher ausschließlich mit dem Isolat ST 57 durchgeführt, darunter eine elektronenmikroskopische Untersuchung und ein Test zum indirekten Nachweis der Abhängigkeit des Wachstums von Cholesterin (Digitonin-Test). Zusätzlich wurden spezifische Kaninchen-Hyperimmunseruen gegen das Isolat ST 57 hergestellt und Immunobinding Assays mit Referenzstämmen und -antiseren nah verwandter Mykoplasmenspezies durchgeführt. Anhand des Typstammes ST 57T wurde somit die neue Spezies Myco-plasma ciconiae sp. nov. beschrieben. Zur molekularbiologischen Identifizierung von M. ciconiae sp. nov. wurde eine speziesspezifische PCR entwickelt. Alle 83 Mykoplasmenkulturen und die DNA-Probe wurden mit dieser PCR untersucht, um die Prävalenz von M. ciconiae sp. nov. in Weißstorchnestlingen zu schätzen.M. ciconiae sp. nov. (ci.coni´ae. L. gen. fem. n. ciconiae eines (Weiß-) Storches) ist pleomorph mit kokkoiden und flaschenartigen Formen mit einer terminalen Protrusion und durch Filter einer Porengröße von 450 nm filtrierbar. Auf SP4-Agarmedium bilden sich typische, spiegeleiförmige Kolonien mit undeutlich abgegrenzten Zentren. Die Spezies wächst bei 37°C unter mikroaerophilen und anaeroben Bedingungen in SP4-Medium und Hay¬flick-Medium. Die optimale Wachstumstemperatur liegt bei 37°C, wobei bei Temperaturen von 23°C bis 42°C ein Wachstum in vitro gezeigt werden konnte. Das Wachstum dieser Spezies wird durch Digitonin gehemmt. Die Spezies verstoffwechselt Glucose, jedoch kein Arginin oder Urea und ist serologisch von nah verwandten Mykoplasmen abgrenzbar. Der Typstamm von M. ciconiae sp. nov. ist ST 57T. Dieser wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sowie der American Type Culture Collection hinterlegt (DSM 25251, ATCC BAA-2401). Die Sequenzen des 16S-rRNA-Gens (KP264571) und der ITS (KP264577) wurden bei GenBank veröffentlicht. Vier zusätzliche Isolate von M. ciconiae sp. nov. wurden bei der DSMZ (DSM 29908-10, DSM 29054) hinterlegt und die Sequenzen des 16S-rRNA-Gens (KP26469, -70, -72, -73) und der ITS (KP26475-78) bei GenBank, sowie die vollständige Speziesbeschreibung im International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology veröffentlicht (MÖLLER PALAU-RIBES et al. 2016). Bei den Sequenzanalysen fanden sich weitere Myko¬plasmenisolate, die keiner der bislang beschriebenen Spezies zugeordnet werden konnten. Die Isolate wurden anhand der Sequenzen des 16S-rRNA-Gens und ITS zwei Gruppen zugeordnet, die beide zum Hominis-Cluster gehören. Anhand der nächsten verwandten Spezies wurden diese als M. gypis- und M. spumans-ähnliche Gruppe benannt. Analog zu Greifvögeln gehören bei Weißstörchen Mykoplasmen möglicherweise zu einer komplexen Trachealmikrobiota. Im Rahmen der Prävalenzstudie war M. ciconiae sp. nov. mittels spezies-spezifischer PCR bei 58,3% (49/84) der untersuchten 83 Kulturen und einer DNA-Probe nachweisbar. Das 95%-Konfidenzintervall lag zwischen 47,1%-69%. In der Studie zeigten sich keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Nachweishäufigkeit zwischen geografischen Regionen, untersschiedlichen Anzahlen an Nestlingen pro Horst und unterschiedlich alten Nestlingen. Aufgrund der hohen Nachweisrate und Verteiung bei klinisch unauffälligen Weißstorchnestlingen, ist M. ciconiae sp. nov. vermutlich apathogen für Weißstörche. Während einige Spezies wie M. ciconiae sp. nov. klinisch ohne Bedeutung zu sein scheinen, könnten andere Spezies, z.B. geflügelpathogene Mykoplasmen, möglicherweise klinische Symptome bei Weißstörchen hervorrufen. Werden bei einem geschwächt oder verletzt aufgefundenen Weißstorch Mykoplasmen nachgewiesen, sollte daher eine Speziesdifferenzierung folgen. Da vermutlich apathogene Spezies in der Trachea gesunder Störche regelmäßig nachgewiesen werden, ist auch bei erkrankten Störchen die Detektion von Mykoplasmen ohne Speziesdifferenzierung nicht ausreichend, um diese als Krankheitsursache zu bewerten. Investigations on the occurrence and significance of mycoplasma in white storks (Ciconia ciconia, LINNAEUS, 1758) and description of a new species (Mycoplasma ciconiae sp. nov.)Mycoplasma are bacteria that lack a cell wall and belong to the class Mollicutes. As important pathogens some species cause significant economic loss to the poultry industry worldwide. Occasionally the occurrence of mycoplasma in debilitated or injured white storks (Ciconia ciconia) has been reported, but little is known about the occurrence of mycoplasma in the free-ranging white stork population. However this knowledge is essential to evaluate the clinical significance of mycoplasma for white storks, and white storks as possible reservoir for poultry pathogenic mycoplasma. In a previous study of clinically healthy free-ranging white stork nestlings in Germany mycoplasma were found to be widespread in the population (HAGEN et al. 2004). No species differentiation was performed, though two isolates (ST 57 and ST 101) were identified that could not be assigned to any previously described species. The aim of our study was to further characterize these two isolates, if possible describe them as representatives of novel species, and evaluate their distribution and potential impact in white storks. From the study HAGEN et al. (2004) 83 mycoplasma cultures and one additional DNA sample were available. Genotypic and phenotypic studies were performed with selected isolates. Phylogenetic studies were based on the sequences of the 16S rRNA gene and the 16S-23S intergenic transcribed spacer region (ITS). The results of these studies demonstrated, that the isolate ST 101 was very closely related to M. spumans and some other species, which made a description as a representative of a novel species impossible. For biochemical characterization of the isolates ST 57 and ST 101 the fermentation of glucose, and the hydrolysis of arginine and urea were investigated. For both isolates optimal growth temperature and temperature range were determined. Both isolates were filtered through 800 nm, 450 nm and 220 nm membrane filters to indirectly prove the lack of a cell wall with a successful passage. Additionally a gram staining was performed to visualise the cells. Further studies served as a basis for the description of a novel species and were therefore only performed with the isolate ST 57. These included electron microscopy and the digitonine inhibition test, which indirectly proves the cholesterol requirement for growth. Furthermore, specific rabbit hyperimmunesera directed against the isolate ST 57 were produced and immunobinding assays with reference strains and -antisera of closely related mycoplasma species were performed. Based on ST 57T as type strain we described the novel species Myco-plasma ciconiae sp. nov. For the molecularbiological identification of M. ciconiae sp. nov. we developed a species-specific PCR. The PCR was performed using all 83 mycoplasma cultures and one DNA sample to estimate the prevalence of M. ciconiae sp. nov. in white stork nestlings.M. ciconiae sp. nov. (ci.coni´ae. L. gen. fem. n. ciconiae of a (white) stork) shows a pleomorphic cell morphology; the cells lack a cell wall and range from coccoid to flask shaped forms. The organism is filterable though 450°nm membrane filters. Fried-egg-shaped colonies with a faintly deliminated center grow on SP4 agar medium. This organism grows in SP4 and Hayflick media at microaerophilic and anaerobic conditions. Tmperature range for growth is 23-44°C, with optimum growth at 37°C. The organism is inhibited by digitonin and acid is produced from glucose. Neither arginine nor urea are hydrolysed. M. ciconiae sp. nov. is serologically distinct from all closely related species of the genus Mycoplasma. The type strain is ST 57T. This strain was deposited at the German Type Culture Collection (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) and the American Type Culture Collection (DSM 25251T, ATCC BAA-2401T). Sequences from the 16S rRNA gene (KP264571) and the ITS (KP264577) were submitted to GenBank. Four further strains were assigned to this species, deposited at the DSMZ (DSM29908-10, DSM29054) and the 16S rRNA gene (KP26469, -70, -72, -73) and the ITS sequences (KP26475-78) were submitted to GenBank. The species description was published in the International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (MÖLLER PALAU-RIBES et al. 2016).During the sequence analyses performed in the present study, further mycoplasma isolates were detected, which could not be identified as representatives of any previously described species. Based on the sequences of the 16S rRNA gene and the ITS, the isolates were assigned to two groups, which both belonged to the hominis cluster. According to the most closeyl related species, the groups were given the names M. gypis-like and M. spumans-like . Similar to birds of prey, white storks seem to have mycoplasma as part of their complex tracheal microbiota. In the prevalence study 58,3% (49/84) of the 83 cultures and one DNA-sample were positive for M. ciconiae sp. nov by species-specific PCR. The 95%-confidence interval was between 47,1% and 69%. No significant differences in prevalence were found between geographical regions, different numbers of nestlings per nest and different age of the nestlings. Based on the high percentage of positive samples and distribution in clinically healthy white stork nestlings we conclude that M. ciconiae sp. nov. is probably nonpathogenic or potentially facultatively pathogenic for white storks. While some mycoplasma species, like M. ciconiae sp. nov., seem not to be of clinical significance, other species, e.g. poultry pathogenic species, might induce clinical symptoms in white storks. If mycoplasma are found in a diseased or debilitated white stork, a species differentiation should be performed. As probably apathogenic mycoplasma species occur frequently in healthy individuals, the detection in diseased individuals is not sufficient to identify mycoplasma as cause of disease.