Epidemiological and diagnostic studies on Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae originating from poultry and non-poultry birds

Abstract

Mycoplasma gallisepticum (MG) and Mycoplasma synoviae (MS) are avian pathogens of worldwide significant economic impact. Definite diagnosis with pathogen identification down to sub-species level represents the first bulwark forcorrect control approach. Furthermore, the role of non-poultry birds in MG and MS epidemiology has not been extensively investigated and outbreaks of MG and MS in poultry farms continue to reappear despite implemented control measurements.The present study includes two parts. Through the first part, 104 German poultry flocks were investigated for MG and MS infection and the occurred Mycoplasma spp. were typed and compared. MG showed lower incidence and was detected in 26 flocks (25%), however MS was identified in 37 flocks (36%). MG genotyping was carried out through pvpA-restriction fragment length polymorphism (pvpARFLP) analysis, sequencing of the MG cytadhesin 2 (mgc2) gene, the MG 16S-23S intergenic spacer region (IGSR) and the phase-variable protein A (pvpA) gene that showed discrimination indexes (D-index) of 0.81, 0.52, 0.86 and 0.94, respectively. Multiple gene-targeted sequencing (GTS) analysis of mgc2/pvpA/IGSR discriminated 18 sequence types (from I to XVIII) within MG strains and showed the highest D-index (0.95). Multiple GTS revealed a characteristic genetic profile of German MG strains that could be differentiated into 4 clusters; a 6/85 like strain, a turkey breeder, in addition to two German characteristic clusters with no relationship to known MG reference strains.MS genotyping was carried out via sequencing of the MS variable lipoprotein and hemagglutinin (vlhA) gene that showed a D-index of 0.83. MS genotyping proved circulation of 15 vlhA sequence types with predomination of two sequence types. Global comparison of vlhA sequences proved genetic relationship between German and Dutch MS strains.Results demonstrated also the importance of periodical surveillance for MG and MS with species identification down to the strain level. Multiple GTS analysis (for MG) and vlhA sequencing (for MS) proved to be dependable, practical genotyping methods capable of intraspecies discrimination that offers also easier inter-laboratory data exchange enabling a better understanding of the genetic evolution of circulating pathogens. Increased MS incidence requires updating of implemented control strategies. International cooperation and coordination for MG/MS control are epidemiologically very important.Through the second part of the study, chicken and contacting free-ranging birds from two naturally MG/MS infected chicken farms (I and II) were simultaneously investigated and compared for MG and MS. From 118 captured free-ranging birds, DNA of genus Mycoplasma was detected in 41 birds. From those, MG-specific and MS-specific DNA were detected in 16 and 9 samples, respectively. The genetic profile of MG was compared through multiple genetargeted sequencing (GTS) analysis of mgc2, pvpA and MG IGSR. Free-ranging birds from both farms areas as well as chickens of farm I showed the same MG lineage that shared identical GTS profile like MG 6/85 vaccine strain. MG of chickens from farm II demonstrated a different GTS profile. The genetic profile of MS was investigated through sequencing of the MS vlhA gene. Free-ranging birds captured on both farms showed two circulating MS lineages which were also detected in chickens of farm I. However, chickens from farm II had only one MS strain in common with free-ranging birds.In conclusion, results of the present study demonstrate the importance of periodical surveillance for MG and MS. Multiple GTS analysis (for MG) and vlhA sequencing (for MS) proved to be robust, practical genotyping methods capable of intra-species discrimination. Sequencing allows also for easier data exchange between laboratories and consequently a more comprehensive understanding of the genetic relationship of internationally circulating strains. Increased MS occurrence necessitates updating of the immediate control strategies. Stronger international cooperation and coordination for MG/MS control are recommended.Moreover, results highlight also the possibility of an epidemiological role played by free-ranging birds, especially the wide spread house sparrows, in MG and MS spread between poultry farms. Hence, suitable control measures to decrease the contact between poultry and free-ranging birds should be quickly launched. Mycoplasma gallisepticum (MG) und Mycoplasma synoviae (MS) sind vogelpathogene Bakterien mit weltweit bedeutenden wirtschaftlichen Auswirkungen. Die genaue Diagnose mit der Pathogenidentifizierung bis zum Unterartenniveau ist die Basis für entsprechende Kontrollmaßnahmen. Außerdem ist die Rolle von frei lebenden Vögeln in der MG- und MSEpidemiologie noch nicht umfassend untersucht worden und Ausbrüche von MG und MS in Geflügelfarmen treten weiterhin auf, trotz durchgeführter Kontrollmaßnahmen.Die vorliegende Studie umfasst zwei Teile. Im ersten Teil wurden 104 Geflügelherden in Deutschland auf MG und MS untersucht, und die nachgewiesenen Mykoplasmen typisiert und miteinander sowie mit der Literatur verglichen. MS zeigte ein häufigeres Vorkommen und wurde in 37 (36%), MG dagegen nur in 26 (25%) Herden entdeckt.Es wurde eine MG-Genotypisierung durch pvpA-Restriction Fragment Length Polymorphism (pvpA-RFLP) Analyse, Sequenzierung des MG Cytadhesin 2 (mgc2)-Gens, MG-16-23 Intergenic Spacer Region (IGSR) und MG Phase-Variable Protein A (pvpA)-Gens durchgeführt. Diese Untersuchungen ergaben Discrimination Indices (D-Index) von 0,81, 0,52, 0,86 und 0,94. Die multiple gene-targeted sequencing (GTS) Analyse der mgc2/pvpA/IGSR-Gene ergab 18 Sequenztypen (von I bis XVIII) mit dem höchsten D-Index (0.95). Die multiple GTS zeigte ein charakteristisches genetisches Profil der deutschen MGs, die in 4 Cluster unterschieden werden konnten; ein MG 6/85-ähnliches Cluster, ein Puteneltern- Cluster, und zusätzlich zwei deutsche charakteristische Cluster ohne Beziehung zu bekannten MG-Referenzstämmen.Die MS-Genotypisierung wurde durch Sequenzanalyse des MS-Variable Lipoprotein und Hemagglutinin (vlhA)-Gens untersucht, welches einen D-Index von 0,83 aufwies. Die MSGenotypisierung zeigte 15 vlhA-typen mit einer besonderen Häufigkeit von zwei Typen. Der Vergleich des gesamten vlhA- Gens mit in der GenBank hinterlegten Sequenzen zeigte genetische Beziehungen zwischen deutschen und holländischen MS- Sequenzen auf.Im zweiten Teil der Studie wurden Hühner und frei lebende Vögel von zwei natürlichen MG/MS infizierten Hühnerfarmen (I und II) gleichzeitig beprobt, und auf MG und MS untersucht, sowie gefundene Sequenzen genotypisiert. Von 118 gefangenen frei lebenden Vögeln wurde DNA der Klasse Mycoplasma in 41 Vögeln entdeckt. Von diesen 41 positiven Tieren wiesen 16 MGspezifische und 9 MS-spezifische DNA auf. Das genetische Profil von MG wurde durch eine Multiple GTS Analyse der folgenden Gene mgc2, pvpA und MG IGSR verglichen. Frei lebende Vögel aus beiden Farmen sowie Hühner der Farm I wiesen identische MG-Genotypen auf, die auch identisch mit dem GTS-Profil des MG 6/85 Impfstammes war. Das GTS-Profil von MG der Hühner von Farm II war jedoch unterschiedlich. Das genetische Profil von MS wurde durch eine MS-vlhA-Sequenzierung untersucht. Frei lebende Vögel auf beiden Farmen wiesen zwei zirkulierende MS-Typen auf, die auch in Hühnern der Farm I entdeckt wurden. Jedoch hatten Hühner von der Farm II nur einen MS-Typ gemeinsam mit der frei lebenden Vögeln derselben Farm.Die Ergebnisse der vorliegenden Studie unterstreichen die Wichtigkeit der regelmäßigen Untersuchung von Geflügelbetrieben auf MG und MS sowie die genaue Analyse der Stammvorkommen. Multiple GTS-analyse (für MG) und vlhA-sequenzierung (für MS) haben sich als praktische Genotypisierungsmethoden zur Differenzierung innerhalb der jeweiligen Spezies erwiesen. Die Sequenzierung bietet auch die Möglichkeit zum Datenaustausch zwischen Laboren. Das hohere Vorkommen von MS sollte zur Aktualisierung der Kontrollstrategien dieses Erregers in Geflügelbetrieben führen. Verstärkte internationale Zusammenarbeit und Koordination für die Kontrolle von MG/MS werden empfohlen. Außerdem unterstreichen die Ergebnisse eine epidemiologische Rolle der frei lebenden Vögel, besonders der Haussperlinge, bei der MG- und MS-Übertragung zwischen Geflügelfarmen. Geeignete Kontrollmaßen für solche Vögel sollten in Betracht gezogen werden.