Zelluläre Wirkungen von Prostaglandin E2 und Prostaglandin D2 auf periphere und zentralnervöse Strukturen des Thermoregulationssystems der Ratte

Abstract

Obwohl eine wichtige Rolle für PGE2 bei der Entstehung von Fieber und einigen anderen Krankheitssymptomen allgemein anerkannt wird, ist das Wissen über die exakten Wirkorte und die durch PGE2 hervorgerufenen zellulären Reaktionen nach wie vor unvollständig. Zentrales Ziel dieser Arbeit war es daher, zelluläre Reaktionen peripherer (Thermosensoren) und zentraler (OVLT und MnPO) Strukturen des Thermoregulationssystems der Säuger gegenüber PGE2 und PGD2 zu untersuchen. Der erste Teil dieser Arbeit beinhaltet Messungen intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen in Primärkulturen von Neuronen aus Spinalganglien. Diese wurden mit dem Pyrogen PGE2, mit dem antipyretischen Faktor PGD2, mit einer Mischung aus PGE2 und PGD2 und mit Menthol, einem Aktivator von Kältesensoren, stimuliert. Die Ca2+-Messung erfolgte mittels Fura-2-abhängigem Ca2+-Imaging. Die Neurone der Spinalganglien konnten gemäß ihres Durchmessers in drei Gruppen eingeteilt werden: kleine Neurone (ca. 15 µm Durchmesser), mittelgroße Neurone (ca. 35 µm Durchmesser) und große Neurone (ca. 55 µm Durchmesser). 96 von 264 untersuchten Neuronen reagierten auf eine Stimulation mit PGE2 mit markanten Ca2+-Signalen. 53 dieser 96 Neurone reagierten auch auf Menthol, was sie als Kältesensoren charakterisierte. 80% dieser Neurone gehörten der mittelgroßen Population (ca. 35 µm Durchmesser) an. In einer weiteren Versuchsreihe untersuchten wir, ob die Stärke der PGE2-induzierten Ca2+-Signale durch PGD2 moduliert wurde. In der Tat wurde in 60% der diesbezüglich untersuchten Neurone (n = 57) beobachtet, dass die Stärke der PGE2-induzierten Ca2+-Signale durch Co-Stimulation mit PGD2 reduziert wurde. Dieser Effekt war auch in der Gruppe der PGE2- und Menthol-responsiven Zellen zu beobachten. Diese Befunde zeigen, dass es antagonistische Effekte von PGE2 und PGD2 auf einen neuronal getragenen Signalweg gibt, der über eine Aktivierung peripherer Kältesensoren inflammatorische Signale zum ZNS weiterleitet. Die Ergebnisse liefern auch eine mögliche alternative Erklärung für die in der Literatur beschriebenen antipyretischen und anti-inflammatorischen Eigenschaften von PGD2. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Effekte von PGE2 und PGD2 auf zentralnervöse Strukturen des Thermoregulationssystems untersucht. Im Rahmen peripherer Entzündungsreaktionen zeigt die Induktion der Enzyme, welche für die Bildung von PGE2 zuständig sind, einen charakteristischen Zeitverlauf in peripheren Organen und im Gehirn. In Bezug zur Fieberreaktion legt dieser Zeitverlauf nahe, dass peripher gebildetes PGE2 für die Induktion der kürzeren, frühen Fieberphase zuständig ist, während zentral gebildetes PGE2 die längere, späte Fieberphase im Bereich des MnPO vermittelt. Die Beeinflussung des Gehirns durch peripher gebildetes PGE2 könnte im Bereich des OVLT erfolgen, welches eine unvollständige Blut-Hirn-Schranke aufweist und für die Fieberentstehung von Bedeutung ist. Die Wirkung von PGE2 im MnPO könnte die Glutamat-getragene Aktivierung einer Neuronenpopulation sein, die auch durch periphere Kältesignale aktiviert wird. Unter Verwendung des Fura-2-abhängigem Ca2+-Imaging wurden Veränderungen intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen in Zellen neuro-glialer Primärkulturen des OVLT und des MnPO der Ratte gemessen. Die Kulturen beider Strukturen wurden mit PGE2 und / oder Glutamat stimuliert. Im Gegensatz zum MnPO reagierten zahlreiche Zellen des OVLT direkt auf PGE2 mit vorübergehenden Anstiegen intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen. Im Einzelnen waren es 8% von 385 untersuchten Neuronen, 19% von 645 untersuchten Astrozyten und 28% von 43 untersuchten Mikrogliazellen. Im MnPO wurden dagegen modulatorische Wirkungen von PGE2 auf die Stärke Glutamat-induzierter Ca2+-Signale nachgewiesen. In 72 von 512 untersuchten Neuronen und in 105 von 712 untersuchten Astrozyten war eine signifikante Verstärkung Glutamat-induzierter Ca2+-Signale zu verzeichnen. Von der Neuronenpopulation die auf diese Weise reagierte, verwendeten ca. 30% GABA als Neurotransmitter. Diese Befunde stehen im Einklang mit einer Funktion von PGE2 als zirkulierender Botenstoff, der das Gehirn auf der Ebene des OVLT beeinflusst und von lokal im MnPO gebildetem PGE2 als Verstärker glutamaterger sympathischer Übertragung. Speziell durch die Wirkung im MnPO wird eine Enthemmung thermoregulatorischer Wärmebildung hervorgerufen, die zur Fieberentstehung beitragen kann. In einer letzten Versuchsreihe wurde die Auswirkung einer Inkubation von OVLT und MnPO Primärkulturen mit PGE2 und PGD2 auf die LPS-induzierte Bildung von Zytokinen (TNF-alpha und IL-6) untersucht. In Primärkulturen beider Hirnstrukturen reduzierte die Inkubation mit PGE2 die LPS-induzierte Freisetzung beider Zytokine (besonders TNF-alpha) in den Kulturüberstand. Im Gehirn scheint PGE2 somit als Feedback-Signal zu wirken, das die Stärke neuroinflammatorischer Prozesse limitiert und somit eine duale Rolle mit pro- und anti-inflammatorischen Eigenschaften spielt. Although a crucial role for PGE2 in the manifestation of fever and other symptoms of illness is well established, the knowledge about the sites of action and the precise cellular effects of this substance is still incomplete. The central goal of this study was therefore to study cellular responses to PGE2 and PGD2 of peripheral (thermosensors) and central (OVLT and MnPO) structures of the mammalian thermoregulatory system. In a first study we measured intracellular Ca2+-concentrations in cultured neurones from rat dorsal root ganglia (DRG) stimulated with the pyrogenic mediator prostaglandin E2 (PGE2), the anti-inflammatory and antipyretic mediator PGD2, mixtures of both PGs, and menthol using the fura-2 ratio imaging technique. Neurons could be grouped according to their size with diameters of about 15 µm (small), 35 µm (medium sized), or 55 µm (large). 96 out of 264 neurons responded to PGE2 with pronounced Ca2+-signals, 53 of them being also responsive to menthol, indicative of their function as cold-sensors. 80% of these neurons belonged to the medium sized group. In a next experiment we tested whether Ca2+-signals of PGE2 responsive neurons were modulated by PGD2. In 60% of all neurons investigated (n = 57) the strength of the PGE2-induced Ca2+-signals was reduced by co-administration of PGD2. This effect was also observed in those neurons that were responsive to PGE2 and menthol (n=23; p< 0.001). This observation indicates antagonistic effects of PGE2 and PGD2 on a neuronal pathway that involves cold sensors and is activated during a localized subcutaneous inflammation. This finding might provide an explanation for the reported antipyretic and anti-inflammatory capacities of PGD2. In a second study effects of PGE2 and PGD2 on central structures of the thermoregulatory system were investigated. The time course of the induction of enzymes responsible for the formation of PGE2 after an inflammatory insult, in relation to the concomitant febrile response, suggests that peripherally generated PGE2 is involved in the induction of the early phase of fever. Centrally produced PGE2 exerts pyrogenic capacities during the later stages of fever within the hypothalamic median preoptic nucleus (MnPO). The actions of peripherally derived PGE2 on the brain might occur at the level of the organum vasculosum laminae terminalis (OVLT), which lacks a tight blood-brain barrier and is implicated in fever, while the effects of PGE2 within the MnPO might interfere with glutamatergic neurotransmission within a recently characterized central efferent pathway for the activation of cold-defence reactions. Using the fura-2 ratio imaging technique we, therefore, measured changes of the intracellular Ca2+ concentration in primary neuroglial microcultures of rat OVLT and MnPO stimulated with PGE2 and / or glutamate. In cultures from the OVLT, as opposed to those derived from the MnPO, substantial numbers of neurons (8% of 385), astrocytes (19% of 645) and microglial cells (28% of 43) directly responded to PGE2 with a transient increase of intracellular Ca2+. The most pronounced effect of PGE2 on cells from MnPO microcultures was its modulatory influence on the strength of glutamate-induced Ca2+ signals. In 72 out of 512 neurons and in 105 out of 715 astrocytes PGE2 significantly augmented glutamate-induced Ca2+ signals. About 30% of these neurons were GABAergic. These observations are in agreement with putative roles of peripheral PGE2 as a directly acting circulating agent at the level of the OVLT, and of central MnPO-intrinsic PGE2 as an enhancer of glutamatergic neurotransmission, which causes disinhibition of thermogenic heat production, a crucial component for the manifestation of fever. In microcultures from both brain sites investigated incubation with PGE2 or PGD2 significantly reduced the lipopolysaccharide-induced release of cytokines (TNF-alpha and IL-6) into the supernatant. PGE2, thus, seems to be involved in a negative feed-back loop to limit the strength of the brain inflammatory process and to play a dual role with pro- as well as anti-inflammatory properties.