Nachweis der Expression und Funktionalität des ABC-Transporters P-Glycoprotein in der Bovine Caruncular Epithelial Cell Line 1(BCEC-1)

Abstract

Dem ABC-Transporter P-Glycoprotein (P-gp), dem Protein des mdr1-Gens, werdenin Mensch, Ratte und Maus fetus-protektive Aufgaben zugesprochen. Er dient einergroßen Reihe an sehr unterschiedlichen Substraten als Transportsystem. Darunterbefinden sich auch zahlreiche veterinärmedizinische Arzneimittel. Seine Rolle ineiner Zelllinie boviner Karunkel-Epithel-Zellen (BCEC-1) sollte in dieser Arbeit imHinblick auf eine Nutzung als in vitro Modell für plazentaren Transport geprüftwerden.RT-PCR-Analysen bewiesen das Vorkommen der mRNA nicht nur dieses Proteins,sondern auch zweier weiterer ABC-Transporter (BCRP und MRP1) in BCEC-1.Zudem konnten alle drei Vertreter in Karunkel- und Kotyledonen-Gewebenachgewiesen werden.Mit Hilfe immunhistochemischer Untersuchungen wurde P-gp der apikalenZellmembran, das heißt der materno-fetalen Kontaktfläche zugeordnet.Die funktionelle Aktivität des Proteins in der Zelllinie konnte mittels FACS-Analysevisualisiert werden. Hierzu wurde der Efflux des P-gp-Substrates Rhodamin123 mitund ohne Einsatz von P-gp-Inhibitoren Verapamil und PSC833 untersucht.Verschiedene Verapamil-Konzentrationen (200 µM, 50 µM, 12,5 µM, 3,125 µM, 0,78µM) erzeugten zum Teil unterschiedlich starke Inhibitionen. So wurden im Mittel mit3,125 µM Verapamil nur noch 55% der Zellen blockiert. Alle höherenKonzentrationen führten eine nahezu vollständige Inhibition herbei, ebenso wie 8 µMPSC833. Eine Dosis von 0,78 µM Verapamil hingegen konnte den Efflux nichtstoppen.Ein Transport-Assay mit dem radioaktiv-markierten P-gp-Substrat Digoxin imTranswell-System diente einem weiteren Nachweis der Funktionalität des Proteins.Die Zellen wurden auf semipermeablen Membranen kultiviert. Die Konfluenz derZellschicht wurde mittels TEER-Messung (transepithelial electrical resistance)überprüft. Zellen mit TEER-Werten über 500 Omega wurden zum Versuch zugelassen undentweder von apikal oder von basal mit markiertem Substrat (10 nM, 100 nM, 1 µM,10 µM) beladen. Probenentnahmen aus dem gegenüberliegenden Kompartiment zuverschiedenen Zeitpunkten (5, 30, 60 und 90 Minuten) detektierten einen stärkerenSubstrat-Flux von basal nach apikal. Der Einsatz von Verapamil (250 µM) für dieInhibition des Digoxin-Fluxes (100 nM) zeigte eine Nivellierung beider Fluxrichtungenauf erhöhtem Fluxniveau. Der stärkere Flux von basal nach apikal wird auf den Effluxdurch das apikal lokalisierte P-Glycoprotein zurückgeführt. Für eine erfolgreicheInhibition des P-gp vermittelten Digoxin-Fluxes durch Verapamil spricht dieAngleichung der Stärke beider Fluxrichtungen. Die Niveauerhöhung wurde auf einein der Literatur berichtete Induktion von P-gp unter Verapamil-Einfluss zurückgeführt.Die nachweislich karunkuläre Herkunft der bovinen Zelllinie bietet im Vergleich zuanderen Zellmodellen, wie den in der Humanmedizin genutzten Choriocarcinoma-Zellinien oder den endometrialen Zellen nicht-trächtiger Rinder, den Vorteil derOrgan- und Funktionsspezifität. Gleichzeitig repräsentiert BCEC-1 aber vor allenDingen maternale Zellen des vierten Trächtigkeitsmonats. Rückschlüsse auf andereTrächtigkeitszeitpunkte sind nicht ohne Weiteres möglich. Desweiteren ist, mit Blickauf die fetus-protektive Funktion des P-gp, stets das fetale Kompartiment zuberücksichtigen. BCEC-1 stellt ein Teilstück der im Ablauf des plazentarenTransportes involvierten Anteile dar.BCEC-1 kann als bovines Zellmodell für die Ermittlung von buiatrisch genutzten,Transporter-spezifischen Substraten und deren Beförderung im maternalenKarunkelepithel herangezogen werden. The ABC-Transporter P-Glycoprotein (P-gp), the mdr1-Gen product, is supposed toprotect the fetus in humans, rats and mice. It serves as transporter for manydivergent substrates, veterinary products among them. In this study, its existence andfunctional role within the Bovine Caruncular Epithelial Cell Line (BCEC-1) weredetermined regarding its use as in vitro model for placental transport.The mRNA of P-gp, BCRP and MRP1 could be detected in BCEC-1 and placentomaltissue using reverse transcriptase PCR.Immunohistochemical analysis revealed a mainly apical localisation of P-gp in thecellular membrane of BCEC-1.Functional activity of the protein was determined by FACS-analysis using P-gpsubstrate Rhodamine123. The efflux of this fluorescent substance was analysed inpresence and absence of the two P-gp inhibitors Verapamil and PSC833. Applicationof several concentrations of Verapamil (200 µM, 50 µM, 12,5 µM, 3,125 µM, 0,78 µM)provoked inhibitions partly differing in strenght. 3,125 µM Verapamil could only block55% of the rhodamine efflux, whereas higher concentrations and PSC833 (8 µM)revealed almost total inhibition. Dosages of 0,78 µM Verapamil did not stop the effluxat all.Radioactive labelled Digoxin, another P-gp substrate, was used to perform atransportion assay in a transwell-system. BCEC-1 was cultured on semipermeablemembranes until reaching confluence, which was confirmed by TEER-measurements(transepithelial electrical resistance). Monolayers producing resistance of more than500 Omega were admitted to the experiment. The substrate (10 nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM)was applied either to the apical or basal side. At several timepoints (5, 30, 60, 90minutes) samples were taken from the opposed compartment. As a result a strongerbasal to apical flux was observed. Application of Verapamil (250 µM) for the inhibitionof the Digoxin (100nM) transportation detected a levelling of the two fluxes on abasically higher flux level. The stronger flux from basal to apical was attributed to theefflux by the apically located P-gp. The levelling of both fluxes was credited to thesuccessful inhibition of P-gp by Verapamil. The concurrent higher level of digoxin fluxmight be attributed to a reported induction of P-gp by Verapamil.The proven caruncular origin of this bovine cell line offers some advantages. Incontrast to human choriocarcinoma cells or endometrial cells derived from nonpregnantcows, BCEC-1 is specific for the organ and the functional state of theplacenta. It represents maternal cells involved in gestation of the fourth month whichrestricts conclusions to that timepoint. Besides, for propositions about the fetusprotectivefunction of P-gp one should take the fetal compartment into account.BCEC-1 represents a part of the transporting systems in the placenta.BCEC-1 can serve as bovine in vitro model for the investigation of buiatric,transporter specific substrates and their transportation across the maternalcaruncular epithelium.