Untersuchungen zur Anwendbarkeit eines integrierten Nachweissystems für Penicillin-Rückstände in Kuhmilch und Ziegenmilch

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Anwendbarkeit eines integrierten Nachweissystems fürPenicillin-Rückstände in Kuhmilch und Ziegenmilch überprüft. Der zweite Schwerpunktdieser Arbeit lag auf der Hemmstoffbelastung von Ziegenmilch, d.h. es sollte ein Überblicküber die Belastung der in Hessen produzierten Ziegenmilch mit Penicillin-Rückständengewonnen werden.Die Kernmethode des integrierten Nachweissystems für Penicillin-Rückstände in Kuhmilchund Ziegenmilch ist ein gruppenspezifischer Enzymimmuntest (EIA) zum Nachweis vonPenicillinen. Durch die Herstellung eines optimierten markierten Antigens (Enzymkonjugat)konnte der Messbereich des Testsystems und somit auch die Nachweisgrenze optimiertwerden. Die 50% Dosis für Penicillin G betrug 0,5 1,5 ng/ml, die Nachweisgrenze lag bei0,3 ng/ml. Der Test erfasst Penicillin G deutlich unterhalb des vorgeschriebenen Höchstwertesvon 4 & #956;g/kg und weist eine breite Gruppenspezifität für alle relevanten Penicilline auf. Alsweitere methodische Bestandteile des integrierten Nachweissystems wurden für ß-lactam-Antibiotika mikrobiologische Hemmstofftests und gruppenspezifische qualitativeRezeptortests eingesetzt, im Bedarfsfall kamen weitere Enzymimmuntests für andereAntiinfektiva zu Einsatz.Während eines Untersuchungszeitraumes von über vier Jahren (10/2001-12/2005) konnten in69 von 79 (87,3 %) hemmstoffpositiven Kuhmilchproben entweder Penicillin- oderCephalosporin-Rückstände nachgewiesen werden. Penicillin G wurde in 61 der 79untersuchten Milchproben identifiziert (77,2 %). Somit ist Penicillin G immer noch der amhäufigsten nachgewiesene Hemmstoff in Milch. Die Rückstandskonzentration lag zumeist imBereich des ein- bis zweifachen MRL (4 ng/ml). In einzelnen Fällen wurden aber auchGehalte über 100 ng Penicillin G/ml festgestellt. In acht der 79 Proben (10,1 %) konntenCephalosporine nachgewiesen werden.Die Untersuchung von Ziegenmilch mittels eines integrierten Nachweissystems ist ebenfallsmöglich. Hierzu müssen jedoch geeignete Methodenkombinationen ausgewählt werden, dasich nicht alle Testsysteme zur Untersuchung von Ziegenmilch eignen. In der vorliegendenArbeit wurden die Enzymimmuntests zum Nachweis von Penicillin G und seinemMetaboliten Benzylpenicilloylsäure (BPO) in Ziegenmilch modifiziert und etabliert. Mittelsdieser, für die Untersuchung von Ziegenmilch sehr gut geeigneten Testsysteme(Nachweisgrenze von 0,37 ng Penicillin G/ml) wurden insgesamt 577 Ziegenmilchproben(Einzelgemelke) aus 13 mittel- und nordhessischen Betrieben untersucht. Neun Proben (1,56%) waren mit Penicillin G kontaminiert. Bei zwei Proben (0,35 %) lag der Gehalt anPenicillin G über dem MRL von 4 ng/ml. Somit ist die Belastung der Ziegenmilch mitPenicillin-Rückständen insgesamt zwar gering, trotzdem aber dennoch in einer nicht alsunerheblich anzusehenden Häufigkeit. The present study describes experiences with an identification and quantification program forpenicillin-residues in cow´s milk and in goat´s milk. Additionally, a survey on the occurrenceof penicillin residues in goat´s milk was performed.To identify and quantify betalactam antibiotics in inhibitor-positive milk samples, acombination of microbiological inhibitor tests, receptor tests, and enzyme immunoassays(EIA) is used in a step-by-step analysis. A generic EIA for penicillins with improvedsensitivity (50% dose concentration for penicillin G 0.5 1.5 ng/ml, detection limit 0.3 ng/ml)was the core method of the program. By this test, penicillin G is detected well below themaximum residue limit (MRL) of 4 μg/kg. The EIA has broad cross-reactivity with all ßetalactamantibiotics which are regulated by MRL´s. Further EIAs (isoxazolyl penicillins,cephalosporins) could be employed in this program if necessary.During the period of four years (10/2001-12/2005), most of the violative milk samples understudy contained penicillin or cephalosporin residues (n =79, 87.3 %). In most cases (77.2 %)penicillin G could be identified. This indicates that penicillin G is still the predominantantibiotic responsible for violative bulk tank milk samples. In most of our results, residuelevels were close to the MRL value (4 ng/ml), but some samples contained more than 100 ngpenicillin G/ml. The second most frequently identified compound were cephalosporins (10.1%).The identification and quantification of antibiotic residues in goat´s milk by the presentedmultimethod strategy is also possible. As only some of the existing antibiotic screening testsare applicable for the analysis of goat´s milk, suitable combinations of tests must be selectedfor the analysis of goat´s milk. In the present study the generic EIA for penicillins and, toindirectly confirm the presence of penicillin G, an EIA specifically detecting penicillin Gmetabolites (benzylpenicilloyl metabolites, BPO) were used. A total of 577 milk samplesfrom 13 goat milk farms were analysed with these high sensitive EIAs (detection limit 0.37 ngpenicillin G/ml). Nine samples (1.56 %) contained penicillin G, at concentrations exceedingthe MRL value (4 μg/kg) in two samples. Compared with about 0.1 % violative cow´s bulktank milk samples as detected during regulary control over the last years, the frequency ofoccurrence of antimicrobial residues in goat´s milk is at least at the same level.