Untersuchung zum Wachstums- und Signalverhalten von kaninen mesenchymalen Stammzellen nach Endorem®-Markierung im MRT

Abstract

In der vorliegenden Studie wurde in der Klinik für Kleintiere - Chirurgie, der Justus Liebig Universität Gießen eine Untersuchung zum Wachstums- und Signalverhalten in der Magnetresonanztomographie von mit Endorem®-markierten kaninen Stammzellen aus dem Fettgewebe durchgeführt. Endorem® (GUERBET) ist ein MRT-Kontrastmittel, das zum Nachweis von Lebertumoren mittels MRT entwickelt wurde. Endorem® enthält Superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPIO). In der MRT-Untersuchung bilden sich Störungen des Magnetfelds um jedes Partikel und führen zu einem Signalabfall in den Geweben, die das Kontrastmittel enthalten (GUERBET).Zunächst wurde eine optimale Endorem®-Konzentration von 319,2 µg/ml Fe (448 myg/ml SPIO) bestimmt, was 28,35 myl/ml Endorem® entspricht. 7 Proben mit kaninen Stammzellen aus Fettgewebe wurden mit dieser Endorem®-Menge über 24 Stunden inkubiert. Die Markierungseffizienz wurde mit Hilfe der Berliner Blau Färbung und MACS-Untersuchung überprüft. Mittels Berliner Blau Färbung konnte gezeigt werden, dass die kaninen Stammzellen spontan Eisenpartikel aus dem Inkubationsmedium aufnehmen. Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie konnte bewiesen werden, dass die Eisenpartikel per Endozytose in die Zelle transportiert werden. Die Eisenpartikel sind in den mit Berliner Blau gefärbten Präparaten 3 Wochen nach der Markierung in den Zellen vorhanden. Die Eisenpartikel werden nicht gleichmäßig an die Tochterzellen übertragen. Es war nicht möglich R eferenzwerte für die Anzahl der markierten Zellen, die mehr als 10 Eisenpartikel enthalten, zum Zeitpunkt 3, 7, 14 und 21 Tage zu bestimmen. Die Trennung der markierten von nicht markierten Zellen mittels MACS-Sortierung stellt eine zuverlässige Methode dar. Der Anteil der markierten kaninen Stammzellen sinkt im zeitlichen Verlauf. Diese Abnahme der markierten Zellen ist statistisch hoch signifikant (p = 0,0007). Eine Referenzwertbestimmung für die Anzahl der markierten Zellen für den Zeitpunkt 1, 2 und 3 Wochen war nicht möglich.Des Weiteren wurden Versuche durchgeführt, die den Einfluss von Endorem® auf die Proliferation, das Zytosklett, die Multipotenzfähigkeit und die Verteilung der Endorem®-Partikeln in der Zelle untersuchen. Mittels Phalloidin Färbung konnte festgestellt werden, dass kein negativer Einfluss von Endorem® auf das Zytoskelett besteht. Die Multipotenz der Zellen wurde anhand der Differenzierung in die adipogene, osteogene und chondrogene Richtung beurteilt. Die adipogene und osteogene Differenzierung bleibt ungestört. Die Knorpelbildung scheint jedoch von Endorem® negativ beeinflusst zu werden. Die Proliferationsfähigkeit der kaninen Stammzellen nach Endorem®-Markierung bleibt im Vergleich zur Kontrollgruppe unverändert. Um die Endorem®-Verteilung in der Zelle zu untersuchen wurde eine transmissionselektronenmikroskopische Analyse durchgeführt. Anhand der Untersuchung konnte beobachtet werden, dass die Endorem®-Partikel per Endozytose aufgenommen werden. Die Eisenpartikel bilden Konglomerate und befinden sich entweder frei im Zytoplasma oder sind in die Lysosomen integriert. Eine und zwei Wochen nach Markierung sind überwiegend freie Konglomerate im Zytoplasma sichtbar. Nach 3 Wochen sind die Endorem®-Partikel in Lysosomen eingebaut. Die Verteilung von Endorem® in der Zelle kann eine Rolle für Kontrastauslöschung in der MRT-Untersuchung spielen. Es wurde eine MRT-Untersuchung von den markierten Stammzellen in Agarphantomen zu drei Zeitpunkten durchgeführt (1, 2 und 3 Wochen nach der Markierung). T2 TSE und T2 FFE Sequenzen kamen zum Einsatz. Es konnte gezeigt werden, dass die im Laufe der Zeit die Stärke der durch Endorem® bedingten Hypointensiät in beiden Sequenzen abnimmt. Die Signalintensität für die Sequenzen T2 TSE und T2 FFE ändert sich im zeitlichen Verlauf über 3 Wochen. Diese Veränderungen sind statistisch hoch signifikant (p = 0,003). Es konnte keine statistisch signifikante Korrelation zwischen MACS-Untersuchung für 1, 2 und 3 Wochen und T2 TSE Untersuchung in der Woche 1, 2 und 3 (für Woche 1: p = 0,945; r = -0,032; für Woche 2: p = 0,242; r = -0,510; für Woche 3: p = 0,288; r = -0,469) und T2 FFE (für Woche 1: p = 0,722; r = -0,166; für Woche 2: p = 0,619; r = -0,231; für Woche 3: p = 0,077; r = -0,705) festgestellt werden. Alle markierten Proben sind 3 Wochen nach der Markierung noch mittels eines 1 Tesla Magnetresonanztomographen in einer T2 TSE und T2 FFE Sequenz darstellbar. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass das Kontrastmittel Endorem® die Voraussetzungen für den klinischen Einsatz für Tracking Studien in vivo bestens erfüllt. The aim of this study performed at the Department of Veterinary Clinical Sciences, Clinic for Small Animals-Surgery, Justus-Liebig-University, Giessen was to investigate the growth behaviour and MRI-Signal properties of adipose-derived canine stem cells after labelling with the MRI contrast agent Endorem® (GUERBET). Endorem® was established to detect liver tumors in humans. This contrast agent contains dextran-coated iron oxide superparamagnetic nanoparticles (SPIO). SPIO affect the T2 relaxation inducing strong field inhomogeneity leading to signal´s decrease in the tissues containing Endorem®. Initially, the optimal labelling concentration was determined to be of 319,2 myg/ml Fe (448 µg/ml SPIO), that corresponds to 28,35 myl/ml of Endorem®. Seven samples with canine adipose-derived stem cells were incubated with this Endorem® concentration for 24 hours. The efficiency of the labelling was investigated with the aid of the Prussian blue staining and the MACS-Method. The spontaneous uptake of SPIOs from the medium containing Endorem® was confirmed with Prussian blue staining. Transmission electron microscopy confirmed the fact that the SPIOs are being incorporated into the canine stem cells by endocytosis. Iron particles were detectable within the cells three weeks after labelling with Endorem®. The iron particles were not equally distributed to the daughter cells during the cell division. It was impossible to set the reference value for the stem cells, that contained more than 10 iron particles within the cell at time intervals three, seven, fourteen and twenty one days. Separation of the labelled cells from the cells that do not contain SPOIs with the MACS is a reliable method. It was demonstrated that percentage of the labelled canine stem cells decreases within three weeks. This decrease of the labelled cells is significant (p= 0,0007). It was not possible to determine the reference value of the percentage of the labelled cells for the time intervals of one, two and three weeks In addition, the influence of the Endorem® labelling on the proliferation ability of the stem cells, cytoskeleton and multipotency was assessed. The distribution of the iron particles within the cell was also investigated. Phalloidin staining showed no negative influence of the iron particles on the cytoskeleton. Multipotency was assessed on the basis of the adipogenesis, chondrogenesis and osteogenesis of the labelled stem cells. Labelled cells underwent osteoegenic and adipogenic differentiation. In contrast to that the chondrogenesis of the labelled cells was negatively affected. Endorem® labelling seems to partially inhibit the chondrogenic differentiation. The labelling had no adverse effects on the proliferation of the stem cells. To assess the distribution of the iron particles in the single cell transmission electron microscopy was performed. It could be demonstrated that Endorem® particles were being incorporated by endocytosis. Iron particles formed clusters free in the cytoplasm or were incorporated in the lysosomes. One and two weeks after labelling the iron clusters were mostly seen free in the cytoplasm. Three weeks after the labelling Endorem®-particles were generally detected in the lysosomes. The further aim of this study was to show duration of Endorem® labelling of cells with a 1 Tesla MRI Tomograph. Agarphantoms with the labelled cells were analysed in the T2 TSE and T2 FFE MRI Sequences one, two and three weeks after the Endorem® labelling. It was determined in both sequences that the hypointensity caused by Endorem® lasted at least for three weeks. T he signal intensity changed for both sequences within three week time period. These changes are significant (p = 0,003). The statistical correlation between MACS for one, two and three weeks and T2 TSE sequence for one, two and three weeks could not been shown (week one: p = 0,945; r = -0,032; week 2: p = 0,242; r = -0,510; week 3: p = 0,288; r = -0,469) and for 2 FFE (week 1: p = 0,722; r = -0,166; week 2: p = 0,619; r = -0,231; week 3: p = 0,077; r = -0,705) It is possible to detect all of the samples of Endorem® labelled stem cells with 1 Tesla MRI in the T2 TSE und T2 FFE sequences 3 weeks after labelling. In this study could be shown that Endorem® is a suitable MRI contrast agent for the clinical tracking studies with adipose-derived stem cells.