Morphologische und funktionelle Charakterisierung eines Mausmodells der Augenkrankheit Retinitis Pigmentosa aufgrund einer Mutation im Rpgr Gen

Abstract

Retinitis Pigmentosa (RP) beschreibt eine heterogene Gruppe erblicher Netzhautdystrophien. Dabei wird der Großteil der X-chromosomalen RP (XLRP) Fälle durch Mutationen im terminalen Exon ORF15 des Retinitis Pigmentosa GTPase Regulator (RPGR) Gens verursacht. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle und weiterführende morphologische Charakterisierung des Rpgrtm1Sti Mausmodells, dessen Punktmutation mit der eines schwer betroffenen, humanen XLRP-Patienten vergleichbar ist und an der im Mäusegenom äquivalenten Stelle im Exon ORF15 generiert wurde.Die Tiere wurden über einen Zeitraum von 21 Monaten in regelmäßigen Abständen untersucht. Um die Funktionalität der Retina zu beurteilen, wurden Elektroretinogramme (ERG) sowohl unter skotopischen, als auch unter photopischen Bedingungen abgleitet. Die morphologische Analyse erfolgte an Gefrierschnitten der Retina, die immunhistochemisch mithilfe von Antikörpern gegen die einzelnen Opsine, GFAP, sowie Rpgr untersucht wurden. Daneben konnte mithilfe der Funduskopie und angiographie der Augenhintergrund der Tiere in vivo beurteilt werden.Die funktionelle Analyse ergab eine erst mit zwölf Monaten auftretende, deutliche Reduktion der skotopischen a-Wellenamplitude betroffener Tiere, die mit zunehmendem Alter weiter fortschreitet. Die Veränderungen der b-Welle traten dagegen unter skotopischen und photopischen Bedingungen erst mit 15 Monaten auf. Funduskopisch konnten bei betroffenen Tieren depigmentierte, diffus über die Retina verteilte Punkte beobachtet werden, wohingegen heterozygote Tiere zunächst flächige Depigmentierungen zeigten. Immunhistochemisch konnte ab einem Alter von neun Monaten eine Delokalisation von Rhodopsin und S-Opsin festgestellt werden, während der Gehalt an LM-Opsin in älteren Tieren abzunehmen scheint. Daneben wurde eine erhöhte Expression von GFAP in den Müllerzellen nachgewiesen.Die funktionelle Analyse ergab eine als mild einzustufende, progressive, Stäbchen-dominierte Netzhautdegeneration. Morphologisch konnten deutliche Veränderungen in der Lokalisation der Opsine sowie eine reaktive Gliose beobachtet werden. Daneben deutet die Rpgr-Färbung in betroffenen Tieren auf eine überwiegende Expression der Isoform RpgrEx1-19 hin, während in wildtyp Tieren RpgrORF15 die vorherrschende Variante darzustellen scheint. Die Charakterisierung dieses neuen Rpgr-Mausmodells stellt einen ersten Schritt auf dem Weg zur Entwicklung erfolgreicher, gentherapeutischer Behandlungsstrategien dar. Retinitis pigmentosa (RP) is a heterogeneous group of hereditary retinal dystrophies. The majority of cases of X-linked RP (XLRP) are caused by point mutations in the terminal exon ORF15 of the gene encoding the retinitis pigmentosa GTPase regulator (RPGR). This study aims at achieving a functional and further morphological characterization of the Rpgrtm1Sti mouse model with a point mutation comparable to a human XLRP patient inserted in the equivalent region of the murine exon ORF15.The animals were investigated in regular intervals between the ages of 1 to 21 months. Electroretinography (ERG) examinations were performed both under scotopic and photopic conditions in order to assess the functionality of the retina. Morphological analysis was carried out using specific antibodies against the different opsins, GFAP, and Rpgr in immunohistochemical procedures on cryosections of the retina. In addition, fundus appearance and vascular structure of the retinae were assessed by means of fundus photography and fundus angiography.The ERG recordings showed a distinct reduction of the scotopic a-wave in affected animals that initially occurs at the age of 12 months and subsequently progresses with age. Decreases of the b-wave amplitudes, however, were first observed at the age of 15 months both under scotopic and photopic conditions. Fundus examinations revealed diffuse, widespread white dots in affected mice, whereas heterozygous animals showed irregular areas of depigmentation. Immunohistochemical procedures detected delocalizations of rhodopsin and S-opsin starting at the age of 9 months, while the expression level of LM-opsin seemed to be reduced in older animals. In addition, Müller cells showed an up-regulation of GFAP.Functional analysis revealed a mild, progressive, rod-dominated retinal degeneration. Morphological examinations showed distinct alterations of the localization of rhodopsin and S-opsin combined with a reactive gliosis of Müller cells. In addition, staining against Rpgr proteins indicated an increased expression of the isoform RpgrEx1-19 in affected mice, while RpgrORF15 seemed to be the predominant isoform in wildtype animals. The characterization of this new mouse model constitutes the first step towards the development of successful gene-based treatment strategies for further retinal gene therapy trials.