Morphogenese von Pestiviren

Abstract

Das Genus Pestivirus umfasst mit dem Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV), dem Virus der Bovinen Virus Diarrhoe (BVDV-1 und -2) und dem Border Disease Virus (BDV) veterinärmedizinisch bedeutsame Virusspezies. Pestiviren werden aufgrund ihrer Morphologie, Genomorganisation und Strategie der Genexpression zur Virusfamilie Flaviviridae gezählt. Zu dieser Familie gehören außerdem die Genera Flavivirus und Hepacivirus. Obwohl die Strukturproteine von Pestiviren seit einigen Jahren bekannt sind, blieben die einzelnen Schritte bei der Entstehung neuer Virionen sowie deren genauer Aufbau, Struktur und Stöchiometrie bisher weitgehend unbekannt. Es wird vermutet, dass sich die Strukturproteine der Virushülle an den Membranen des rauen endoplasmatischen Retikulums (rER) anreichern. Virionen entstehen demnach durch Knospung ("Budding") an intrazellulären Membranen, wobei Kapside mit Genom in die Hülle eingeschlossen und Virionen anschließend über den sekretorischen Weg ausgeschleust werden.Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Morphologie und Morphogenese von Pestiviren durch Einsatz ultrahistologischer Verfahren aufzuklären. Im ersten Teil der Arbeit wurden mithilfe von Wachstumskurven und Nukleinsäure-Quantifizierung Infektionsmodelle erarbeitet, die anschließend im zweiten Teil der Arbeit ultrahistologische Studien an pestivirusinfizierten Zellen ermöglichten. Es stellte sich heraus, dass insbesondere das Pestivirus Giraffe-1 durch eine vergleichsweise hohe intrazelluläre Virionenkonzentration für ultrahistologische Studien geeignet ist. Die EM-Untersuchungen konnten den vermuteten Weg für die Virusmorphogenese und -ausschleusung aus der Zelle durch den Nachweis von Virionen im ER, Golgi-Komplex, Transportvesikeln und bei der Exozytose belegen. Der Moment des Budding konnte allerdings nicht gezeigt werden. Intrazelluläre Membranalterationen, bei Vertretern der Genera Flavivirus und Hepacivirus beschrieben als Folge der Bildung viraler Replikationskomplexe, wurden für die verwendeten Infektionsmodelle in Kulturzellen nicht beobachtet. Im dritten Teil der Arbeit sollten schließlich antigenerhaltende Verfahren zum Nachweis von Pestivirusproteinen in infizierten Zellen eingesetzt werden. Es wurden Protokolle zu Methacrylat-Kunststoffeinbettungen sowie Gefriereinbettungen nach TOKUYASU eingeführt. Zur Etablierung der Verfahren wurden u. a. Expressionssysteme gewählt, die eine Überexpression viraler Proteine erlaubten. Basierend auf den Auswertungen der Markierungsversuche an diesen Expressionsmodellen wurde schließlich die Methode nach TOKUYASU zur Untersuchung pestivirusinfizierter Zellen ausgewählt. Am Institut stand eine Reihe von Antikörpern zum Nachweis von Pestivirusproteinen zur Verfügung, mit denen der Nachweis des Kapsidproteins, der Hüllproteine Erns, E1 und E2 sowie von dsRNS als Marker für virale Replikationskomplexe gelang. Für das Kapsidprotein und E2 konnte durch Kolokalisationsexperimente mit dem ER Marker PDI eine Lokalisierung im endoplasmatischen Retikulum nachgewiesen werden. Interessant ist, dass das Kapsidprotein, Erns, E2 und dsRNS in Vesikeln/ Vakuolen des endosomalen Kompartiments vorliegen. Es bleibt zu klären, wie Pestiviren in dieses Kompartiment geraten bzw. eindringen. Weiterhin ist noch unklar, ob für sie dadurch Vorteile für die Virionenfreisetzung entstehen oder ob es sich vielmehr um eine Entsorgungsmaßnahme der infizierten Zellen handelt, bei der Virionen degradiert werden.Mit der Methode nach TOKUYASU wurde eine attraktive Möglichkeit zum Virusproteinnachweis und für Kolokalisationsstudien im ultrastrukturellen Bereich infizierter Kulturzellen erfolgreich etabliert. Die in dieser Arbeit eingesetzten Methoden zur ultrastrukturellen Analyse von pestivirusinfizierten Zellen legen aufgrund der erzielten Ergebnisse den Grundstein für weiterführende Kolokalisationsexperimente. Weiterhin sollte auf der Grundlage der erzielten Ergebnisse zur Darstellung von Pestivirionen der Einsatz der Elektronentomografie in Betracht gezogen werden, um eine dreidimensionale und somit verbesserte Auflösung zellulärer/ viraler Strukturen zur besseren Analyse von Morphogeneseprozessen zu erreichen. The genus Pestivirus comprises with Classical Swine Fever Virus (CSFV), Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV-1 and -2) and Border Disease Virus (BDV) virus species of great importance in veterinary medicine. Pestiviruses are assigned to the virus family Flaviviridae due to their virion morphology, genome organisation and strategy of gene expression. Additional members of this family are the genera Flavivirus and Hepacivirus. Although pestiviral structural proteins are known for many years several aspects of virion assembly remained unknown as well as virion composition, structure and stoichiometry. It is assumed that the structural proteins of the viral envelope accumulate at membranes of the rough endoplasmic reticulum (rER). Accordingly, virions are thought to bud at intracellular ER derived membranes where the capsid containing the viral genome is surrounded by the viral envelope. Afterwards virions are supposed to be released from cells via the host cell secretory pathway. The aim of the present work was to examine morphology and morphogenesis of pestiviruses in infected culture cells using ultrahistological methods. In the first part of the thesis infection models were established based on virus growth curves and quantification of viral nucleic acid. In the second part these models allowed ultrahistological studies on pestivirus infected culture cells. It turned out that especially the pestivirus Giraffe-1 is suitable for ultrastructural studies due to the relatively high intracellular virus load. The electron microscopy examinations demonstrated the supposed pathway of pestiviral morphogenesis and egress from infected cells by virion detection inside the ER, Golgi complex, transport vesicles and exocytosis vesicles. The moment of virus budding could not be clearly shown. Intracellular membrane alterations, described as side effect of viral replication complex formation in flavivirus and hepacivirus replication were not observed in culture cells for the pestivirus infection models.In the third part of the project antigen preserving methods were applied for ultrahistological detection of pestiviral proteins in infected culture cells. Within the scope of this work protocols for methacrylate-resin embedding as well as cryo-embedding (TOKUYASU) were introduced. To establish the methods cell culture expression models were chosen which allowed over-expression of viral proteins. The cryo-embedding method of TOKUYASU was applied for labeling experiments of pestivirus infected culture cells. At the institute a set of antibodies against different pestivirus proteins was available. In the scope of this work the detection of the capsid protein, the envelope proteins Erns, E1 and E2 as well as of dsRNS as marker for viral replication complexes was accomplished. By colocalisation experiments with the ER marker PDI a localisation in the ER could be shown for the capsid protein and E2. An interesting finding was the localisation of the capsid protein, Erns, E2 and dsRNS in vesicles/ vacuoles of the endosomal compartment. It remains to be clarified whether pestiviruses enter this compartment in order to utilize distinct mechanisms for their replication or whether this detection reflects efforts of the infected cells to eliminate the virus.With the method of TOKUYASU an attractive method for virus protein detection and colocalisation studies on the ultrastructural level has been established. The methods for ultrastructural analysis of pestivirus infected cells applied in this work represent the basis for further colocalisation experiments. Based on the presented results of pestivirion detection the application of electron tomography should be considered. This will allow a three dimensional and therefore improved resolution of cellular and viral structures and thereby an extensive analysis of virion morphogenesis processes.