Studien zur Neuroinvasion und zum axonalen Transport von Mutanten des Pseudorabiesvirus im Tiermodell und an Neuronenkulturen

Abstract

Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass PrV in der murinen neuronalen Zellkultur intraaxonal anterograd in Form von vollständig umhüllten Viruspartikeln in Vesikeln transportiert wird.2. PrV-Bartha ist in vitro auch zum anterograden Kapsidtransport fähig.3. Die Deletion von pUS9 und pUL11 führte erst 48 h p.i. in Neuronen zum Nachweis von anterogradem Kapsidtransport. Dies konnte auch nach Doppeldeletion beider Proteine beobachtet werden.4. Die Deletion von gE führte in vitro nicht zur Beeinträchtigung des anterograden Transportes.5. Bei Abwesenheit von pUL37 fand 24 h p.i. kein anterograder Kapsidtransport statt.6. Die Proteine pUL37 und pUL36 sind nicht essentiell für den retrograden Transport zum Zellkern. In vivo fehlt bei Abwesenheit beider Proteine jedoch eine Neuroinvasion.7. In Mäusen erfolgte die In-vivo-Charakterisierung einzelner UL36-Deletionsmutanten. Dabei zeigte sich, dass die Deletion einzelner Aminosäuren am 3 - oder 5 - Ende lediglich eine leicht verzögerte Neuroinvasion zur Folge hatte.8. Der Austausch des aktiven Zentrums in der Deubiquitinierungsdomäne von pUL36 führte zu einer zweifach verlängerten Überlebenszeit in infizierten Mäusen.9. In-vivo-Untersuchungen mit PrV-UL35 und PrV-UL35GFP belegten, dass eine Fusion von pUL35 mit GFP zur funktionellen Deletion des Proteins führte.10. PrV-UL21/US3 zeigte in vivo einen stark veränderten Phänotyp im Vergleich zum Wildtyp. Die intranasale Inokulation führte nur bei der Hälfte der Tiere zum Tod. Pathohistologisch fand sich in den Mäusen eine hochgradige Meningoenzephalitis mit zahlreichen infizierten kortikalen Neuronen.11. In der neuronalen Zellkultur konnte nach Infektion von PrV-UL21/US3mCherry kein anterograder Kapsidtransport nachgewiesen werden.12. Die intradermale Inokulation von PrV-Kaplan in Mäusen führte zur Neuroinvasion über das Rückenmark und zum Nachweis infizierter Neuronen im somatosensorischen Cortex ab 90 h p.i.13. Die intranasale Infektion von Haus- und Wildschweinen mit PrV-NIA3 ergab eine mittlere Überlebenszeit von 5-7 d. Die histopathologischen und immunhistologischen Befunde sind in den Haus- und Wildschweinen identisch.14. Mittels Real-time PCR gelang der Nachweis von PrV-DNA bei allen Tieren aus Tonsille, Trigeminalganglion und Großhirn.

Electron microscopic investigations revealed that in murine neuronal cell culture PrV is transported intra-axonally anterogradely in the form of completely enveloped virus particles within vesicles.2. In vitro, PrV-Bartha is also capable of anterograde capsid transport.3. After deletion of pUS9 and pUL11 anterograde capsid transport was not detectable in neurons until 48 h p.i. This was also observed after simultaneous deletion of both proteins.4. In vitro, anterograde transport was not affected by deletion of gE.5. In the absence of pUL37 no anterograde capsid transport was observed 24 h p.i.6. The proteins pUL37 and pUL36 are not essential for retrograde transport to the cell nucleus. In vivo, however, neuroinvasion does not occur in the absence of both proteins.7. In vivo characterization of individual UL36 deletion mutants was done in mice. It was shown that deletion of individual amino acids at the 3 - or 5 -terminus only resulted in a slight delay of neuroinvasion.8. The survival time of infected mice was twice longer after exchange of the active-site cystein of the deubiquitinating domain of pUL36.9. In vivo investigations with PrV-DUL35 and PrV-UL35GFP showed that fusion of pUL35 with GFP leads to functional deletion of the protein.10. In vivo PrV-UL21/US3 showed a strongly modified phenotype compared to the wildtype. After intranasal inoculation only 50 % of the animals died. Pathohistologically, the mice showed severe meningoencephalitis with numerous infected cortical neurons.11. In neuronal cell culture, no anterograde capsid transport was detected after infection of PrV-UL21/US3mCherry.12. Intradermal inoculation of PrV-Kaplan in mice resulted in neuroinvasion via the spinal cord and in detection of infected neurons in the somatosensoric cortex starting 90 h p.i.13. The mean survival time of domestic pigs and wild boar after intranasal infection with PrV-NIA3 was 5-7 d. The pathohistological and immunohistological findings in domestic pigs and wild boar are identical.14. By real-time PCR PrV-DNA was detected in the tonsils, trigeminal ganglion and cerebrum of all animals.