Antikörper gegen Proteinase 3 induzieren eine granulozyten-mediierte Lungenschädigung-Etablierung eines experimentellen Modells der akuten Wegener´schen Granulomatose am Beispiel der permanent ventilierten und perfundierten Rattenlunge

Abstract

Nach ihrer Erstbeschreibung durch Davies 1982 wurden die anti-neutrophilen zytoplasmatischen Antikörper (cANCA) erstmals 1985 von van der Woude mit dem Krankheitsbild der Wegener´schen Granulomatose (WG) in Verbindung gebracht. Wurde die Proteinase 3 (PR3) 1990 bereits als ihr Zielantigen identifiziert, so gelten cANCA gegen PR3 mittlerweile als hochsensitiver und spezifischer Seromarker für die WG. Des Weiteren wird diesen Autoantikörpern eine entscheidende pathogenetische Funktion für die Entstehung und die Chronifizierung der Erkrankung zugeschrieben. Da die Lunge einen der Hauptmanifestationsorte der WG darstellt, und es in schweren Fällen zum akuten Lungenversagen (ALI) kommen kann, sollte in der vorliegenden Arbeit ein Modell etabliert werden, mit dessen Hilfe die pulmonal stattfindenden pathophysiologischen Veränderungen im ALI in der WG reproduziert und die involvierten Mechanismen charakterisiert werden konnten. Um zu überprüfen, ob die permanent ventilierte und perfundierte Rattenlunge das hierfür geeignete Modell darstellen könnte, musste zunächst untersucht werden, ob die humanen neutrophilen Granulozyten (PMN) als Zielzellen für cANCA auch in der Rattenlunge zur Adhäsion befähigt waren. Die histologischen Analysen hierfür angefertigter Kryoschnitte von Lungen aus verschiedenen Versuchsgruppen zeigten deutlich, dass es zur erforderlichen Anheftung der humanen PMN-Zellen in der Rattenlunge kam und sich das Modell der permanent perfundierten und ventilierten Rattenlunge unter Ko-Perfusion von humanen PMN-Zellen für die Durchführung der vorliegenden experimentellen Arbeit sehr gut eignete. Vorversuche zeigten, dass die Vorinkubation der Granulozyten mit TNF& #945;, wodurch eine Translokation des Autoantigens PR3 an die Zelloberfläche bewirkt wurde, eine wichtige Voraussetzung für die Interaktion der neutrophilen Granulozyten mit cANCA darstellte. Als Surrogat für cANCA wurden murine monoklonale Anti-PR3-Antikörper eingesetzt. Während die Perfusion von cANCA per se oder unbehandelter Granulozyten zusammen mit cANCA keinerlei Effekt hatte, bewirkte die Injektion vorstimulierter Granulozyten in Kombination mit cANCA in den Lungen eine extreme Gewichtszunahme. Da auch TNF-vorbehandelte Granulozyten alleine sowie auch in Kombination mit einem Kontrollantikörper in der Lunge keine Veränderung auslösten, konnte davon ausgegangen werden, dass das sogar makroskopisch sichtbare Lungenödem auf eine spezifische Aktivierung PR3-exprimierender Granulozyten durch cANCA zurückzuführen war. Neben der Gewichtszunahme diente der Kf,c, der sog. Kapilläre Filtrationkoeffizient, als Indikator der Schrankenstörung. Durch Ko-Perfusion von TNF- geprimten neutrophilen Granulozyten und cANCA wurde eine extreme Steigerung des Kf,c verursacht. Die Tatsache, dass der pulmonalarterielle Druck hingegen konstant blieb, wies darauf hin, dass es sich hierbei um eine primäre endotheliale Schrankenstörung handelte, die nicht durch erhöhten Druck in der Pulmonalarterie verursacht worden war. Zur weiteren Charakterisierung der involvierten Mechanismen kamen Inhibitoren zum Einsatz, die zur Hemmung granulozytärer Mediatoren führen sollten, deren Beteiligung bei der Entstehung des Lungenödems diskutiert wird. Zunächst wurde die Beteiligung von reaktiven Sauerstoffspezies an der Entstehung des cANCA-induzierten Lungenversagens untersucht. Zum Einsatz kam DPI, ein spezifischer Inhibitor der NADPH-Oxidase, der die Entstehung von Superoxid-Anion verhindert. Dieses wird dann innerhalb dieser Kaskade von SOD in eine weniger aktive Form überführt. Sowohl DPI als auch SOD führten nach Gabe in das Perfusionssystem zu einer signifikanten Verringerung der Ausbildung eines Lungenödems. Folglich spielten Sauerstoffradikale eine sehr wichtige Rolle in diesem Modell der cANCA-induzierten pulmonalen Schädigung. Die Frage, ob das Enzym Elastase und sein Potential, humane Zellen zu schädigen, in diesem Modell involviert waren, wurde geklärt, indem der spezifische Elastase-Inhibitor AAPVCK zum Einsatz kam. In Gegenwart des Elastase-Inhibitors war das durch Perfusion cANCA-aktivierter Granulozyten induzierte Lungenödem deutlich gemildert. Dies deutete auf einen entscheidende Rolle dieses Enzyms im vorliegenden Modell hin. Die Hemmung der Leukotriene durch den 5-Lipoxygenase-Inhibitor MK886 hingegen konnte nicht verhindern, dass sich im Lungengewebe massiv Flüssigkeit infolge gesteigerter Permeabilität der Endothelien einlagerte. Zusammenfassend ist es gelungen, mit der permanent perfundierten und ventilierten Rattenlunge ein Modell der pulmonalen Wegener´schen Granulomatose zu etablieren, an dem eine pathogenetische Rolle für die cANCA-induzierte Granulozytenaktivierung belegt wurde. Darüber hinaus gelang es zu konkretisieren, dass granulozytär freigesetzte reaktive Sauerstoffspezies und Elastase an der Bildung der pulmonal-endothelialen Schrankenstörung beteiligt waren. Dies eröffnet Perspektiven zum künftigen Einsatz spezifischer Pharmaka beim Lungenversagen in der WG. After their first description in 1982 by Davies, anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (cANCA) were for the first time related to the clinical picture of Wegener´s granulomatosis (WG) by van der Woude in 1985. In 1990, Proteinase 3 (PR3) was already identified as main target of cANCA and cANCA targeting PR3 are known as a highly sensitive and specific seromarker of WG. Moreover, an important pathogenic role for the development and the chronification of the disease has been proposed for these autoantibodies. As the lung represents the organ most frequently involved in WG and fulminant disease can present as acute lung injury (ALI) the aim of the current study was to establish a model which could help to reproduce the acute pulmonary pathophysiological changes in ALI due to WG and to characterize the mechanisms involved. To find out whether the permanently ventilated and perfused isolated rat lung could be a suitable model it first had to be tested if human neutrophil granulocytes (PMN), the target cells of cANCA, were also able to adhere at the endothelium of rat lungs. Histological analyses of the prepared cryosections of the lungs from different experimental groups showed clearly that human PMN effectively adhered to the rat pulmonary endothelium, thus allowing the conclusion that the permanently perfused and ventilated rat lung was most suitable for the present study. Preliminary experiments showed that pre-incubation of PMN with TNFα, a process which provokes translocation of the autoantigen PR3 to the cell surface was an important prerequesite for the interaction between neutrophils and cANCA. A murine monoclonal anti-PR3-antibody was used as surrogate for cANCA. While sole perfusion of cANCA per se or unprimed PMN together with cANCA had no effect on pulmonary physiology, co-perfusion of TNF-primed neutrophils and cANCA induced a massive weight gain in isolated rat lungs. Moreover, as this effect was not observed when lungs were solely perfused with TNF-primed PMN or co-perfusion with an isotype-matched control-IgG was performed, one can conclude that specific activation of PR3-expressing granulocytes by cANCA was underlying the even macroscopically observed lung edema formation. Not only the weight gain but also the capillary filtration coefficient (Kf,c) was used as a marker of increased pulmonary endothelial permeability. Co-perfusion of TNF-primed neutrophils and cANCA caused an extreme raise in the Kf,c. In contrast, the pulmonary artery pressure was not affected, indicating that ANCA-induced pulmonary edema formation was due to a primary injury of the pulmonary endothelial barrier function and not secondarily induced by any increase in pulmonary artery pressure. To further characterize the involved mechanisms pharmacological inhibition of different neutrophil-derived mediators which are discussed to be implicated in the development of lung edema was performed. First, the influence of reactive oxygen species in the pathogenesis of ANCA-induced lung injury was investigated. DPI, a specific NADPH-oxidase inhibitor, preventing the synthesis of superoxide (O2-) was employed. On this level SOD catalyses the dismutation from superoxide to the less active hydrogen peroxide (H2O2). Both oxygen radical suppressors, DPI and SOD, induced a significant reduction in the development of lung edema. Thus, oxygen radicals played an important role in this model of cANCA-induced pulmonary lesions. To answer the question if the enzyme elastase and its potential ability to damage human cells could play a role in this model of lung injury, the specific inhibitor of elastase AAPVCK was used. In the presence of this elastase-inhibtor the cANCA-induced lung injury was considerably moderated. The results revealed that elastase was centrally involved in the pathogenesis of cANCA-induced lung injury. Inhibiting the leukotrienes by the 5-lipoxygenase-inhibitor MK886 could not prevent the formation of a massive lung edema as a consequence of an increased endothelial permeability. In conclusion, the aim of establishing a model of the pulmonary Wegener´s granulomatosis was reached by using the permanently perfused and ventilated isolated rat lung. In this model, evidence for a pathogenic role of the cANCA-induced activation of neutrophils was provided. Moreover, neutrophil derived reactive oxygen species and elastase were identified to be causally involved in the present disruption of the pulmonary endothelial integrity. This model provides the possibility to develop therapeutic strategies for the future treatment of lung injury in fulminant WG