Untersuchungen zum Differenzierungszustand von Sertoli Zellen in Mäusen mit Sertoli zellspezifischem Knockout des Connexin 43-Gens (SCCx43KO)

Abstract

Zellpopulationen über verschiedene Mechanismen reguliert. Die direkteKommunikation mittels GJ-Kanälen erlaubt einen unmittelbaren Austausch vonkleinen Molekülen und reguliert essenzielle Prozesse während der Proliferation undDifferenzierung von Zellen. Das GJ-Protein Cx43 ist dabei das vorherrschende Cx imHoden der meisten Spezies. Im murinen Keimepithel wird es p. c. vom Tag 11,5 anexprimiert und ist zwischen benachbarten SZ und zwischen SZ und bestimmten KZlokalisiert. In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass Veränderungen in derCx43-Expression mit einer gestörten Spermatogenese bei Menschen und Nagernsowie Hodentumorentwicklung beim Mann und Hund assoziiert sind.Der generelle KO des Cx43-Gens führt zu einer Herzmissbildung und infolgedessenzum Tod der transgenen Mäuse unmittelbar nach der Geburt. Um diese Problematikzu umgehen und die SZ-spezifische Rolle von Cx43 auf die testikuläre Entwicklung,Spermatogenese und SZ-Reifung in vivo untersuchen zu können, wurde mit Hilfe desCre/loxP-Rekombinasesystem eine lebensfähige konditionale KO-Mausliniegeneriert, bei der das Cx43-Gen ausschließlich in den SZ fehlt. Verglichen mit ihrenWT-Wurfgeschwistern zeigen männliche SCCx43KO-Mäuse keine Unterschiede imKörpergewicht und auch Nebenhoden, Samenleiter und akzessorischeGeschlechtsdrüsen sowie der Hodenabstieg erscheinen unverändert. Die Größe unddas Gewicht der Hoden dieser KO-Mäuse sind jedoch drastisch reduziert. Die Tieresind infertil und zeigen histologisch einen Arrest der Spermatogenese auf der Stufeder Spermatogonien oder SCO-Tubuli. Darüber hinaus treten abnormaleintratubuläre Zellcluster, Vakuolen im Zytoplasma von SZ und eine Hyperplasie derinterstitiellen Leydig Zellen auf. Eine statistische Analyse ergab zudem, dass diedurchschnittliche Anzahl der Spermatogonien pro Samenkanälchen in adultenSCCx43KO-Mäusen verglichen mit ihren WT-Wurfgeschwistern signifikant reduziertist. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der somatischen SZpro Tubulus signifikant erhöht ist und sie auch nach der Pubertät noch proliferieren.Dabei sei zu erwähnen, dass adulte SZ als postmitotische Zellen angesehen werden,sie sich normalerweise mit der Pubertät ausdifferenzieren und danach keineZellteilung mehr zeigen. Diese Ergebnisse betonen den kritischen Beitrag von Cx43auf den Reifungsprozess von SZ, welcher normalerweise während des pubertärenZeitraums in einer Beendigung der mitotischen Zellteilung resultiert.Aus diesem Grund war eine Untersuchung der SZ-Reifung in diesem neuentransgenen Mausmodell von besonderem Interesse und das Hauptziel dieser Arbeit,den Differenzierungsstatus von SZ auf ultrastruktureller, Protein- und mRNA-Ebenezu bestimmen. Darüber hinaus erfolgte die Erforschung der in den SCCx43KOMäusenbeobachteten abnormalen intratubulären Zellcluster. Untersucht wurdenzum einen ihr exakter Auftrittszeitpunkt und zum anderen die Zusammensetzung, derDifferenzierungszustand und das Schicksal der Zellen in diesen Zellaggregaten.Zusammengefasst kann gesagt werden, dass adulte Cx43-defiziente SZ trotz derAusbildung einer adulten Morphologie, der Expression von adulten und dem Verlustvon immaturen Differenzierungsmarkern weiterhin proliferieren können. Diesimpliziert einen einzigartigen und abnormalen intermediären Phänotyp mitEigenschaften von sowohl undifferenzierten als auch differenzierten SZ. In the testis, intercellular communication is regulated through certain mechanismsbetween different cell populations. The direct communication via gap junctionchannels allows intercellular passage of small molecules and regulates essentialprocesses during cell proliferation and differentiation. The gap junctional proteinCx43 is the predominant Cx in testis of most species. In the seminiferous epitheliumof mouse testes, it is expressed from day 11.5 p. c. and located between neighboringSCs and between SCs and specific germ cells. In the past, alterations of Cx43expression were found to be associated with germ cell tumorigenesis in men anddogs as well as spermatogenic impairment in humans and rodents.Total disruption of the Cx43 gene leads to altered cardiac morphology and to suddenperinatal death. In order to circumvent the problems of the general Cx43 deficiencyand to clarify the SC specific roles of Cx43 on testicular development, spermatogenesisand SC maturation in vivo, a viable conditional Cx43KO mouse line hasbeen generated successfully using the Cre/loxP recombination system, which lacksthe Cx43 gene solely in SCs. Adult SCCx43KO mice showed normal testis descentand development of the urogenital tract, but testis size and weight were drasticallylower when compared with WT and heterozygous littermates. Histological analysisrevealed that SC specific deletion of Cx43 mostly results in an arrest ofspermatogenesis at the level of spermatogonia or SC-only syndrome, as well as:abnormal intratubular cell clusters, SC cytoplasmic vacuoles, increased SC numbersand reduced number of spermatogonia per seminiferous tubule. Furthermore, as SCswere found to be still proliferating in adult KO mice, it was postulated that lack ofCx43 expression in SCs caused these somatic cells to remain in an apparentlypermanent proliferative state. These results emphasize the critical contribution ofCx43 to the normal maturational progression of SCs which normally results in thecessation of SC mitogenesis during the pubertal period.Taken these results into account, the study of SC maturation in this new transgenicmouse model was clearly needed to elucidate whether still proliferating Cx43deficient adult SCs exhibit additional immature features at functional and/ormorphological level. Thus, the primary objective was to determine the state of SCdifferentiation at ultrastructural, protein and mRNA levels. Furthermore, the time ofoccurrence, composition, differentiation and fate of cells belonging to the observedintratubular cell clusters in SCCx43KO mice were also investigated.In conclusion, adult Cx43 deficient SCs seem to proliferate while maintainingexpression of mature markers and their adult morphology, indicating a unique andabnormal intermediate phenotype with characteristics common to bothundifferentiated and differentiated SCs.