Vergleichende morphologische Untersuchungen am Tibiabohrlochmodell des Schafes zur Fremdkörperreaktion nach Implantation von Calciumphosphat-basierten Knochenersatzstoffen

Abstract

Ziel der vorliegenden tierexperimentellen Studie war es, am Tibiakopf-Bohrlochmodell des Schafes drei CaP-basierte Knochenersatzstoffe unter besonderer Berücksichtigung der Fremdkörperreaktion in der Frühphase p.i. zu untersuchen.Hierzu wurden 2 Jahre alte Merino-Schwarzkopfschafe in 4 Versuchsgruppen aufgeteilt und an der linken Tibia operiert. Von medial wurde ein Knochenzylinder von 12 mm Durchmesser und 20 mm Tiefe entnommen. Im Anschluss wurden die Defekte bei den Tieren der ersten Gruppe mit Tricalciumphosphat (TCP)-Zement (Gruppe I / TCP; n=3), bei den Tieren der zweiten Gruppe mit einem Calciumphosphat (CaP)-Granulat (Gruppe II / CaP; n=2) und bei den Tieren der dritten Gruppe mit einem Calciumphosphat (CaP)-Zement modifiziert mit 10 mg/g Phosphoserin (PS) (Gruppe III / CaP-PS; n=5) gefüllt. Mittels eines Knochendeckels, der aus den jeweils entnommenen Knochenzylindern passgenau gesägt wurde, erfolgte der Defektverschluss. Bei den als Kontrolle dienenden Tieren der vierten Gruppe (Gruppe IV / leer; n=3) wurde der unbefüllte Defekt mit einem Knochen-deckel verschlossen. 10 Tage post operationem wurden die Tiere euthanasiert und nach Perfusion der linke Tibiakopf entnommen.Der lichtmikroskopischen Untersuchung dienten Paraffinschnitte, Dünnschliffe und Semidünnschnitte. Dazu wurden die Proben in unterschiedliche Medien eingebettet (Paraffin, Kunststoff (Technovit T7200 und Technovit T9100), Harz (EPON). Die Schnitte und Schliffe wurden zur histomorphologischen Untersuchung gefärbt (Hämatoxylin-Eosin, Toluidin-Blau, Safranin O) oder der Immun- (CD68/CD44) sowie der Enzymhistochemie (TRAP) zugeführt.Um das räumliche Muster der Fremdkörperreaktion deskriptiv erfassen zu können, erfolgte eine ringförmige Einteilung der Defekte in 3 Zonen: Die Defektperipherie beinhaltet das Knochenlager und begrenzt mit der Bohrkante den Defekt. Dieser wurde weiter unterteilt in die Defektmitte, welche nach zentral an das Defektzentrum angrenzt.Die drei Knochenersatzstoffe unterscheiden sich schon in der Übersichtshistologie erheblich voneinander: Während der TCP-Zement der Gruppe I in situ fragmentiert und die Defekte so bis in das Defektzentrum für Zellen erschließbar werden, wird der mit CaP-Granulat versorgte Defekt nicht nur entlang der Granulatoberflächen erschlossen, sondern auch innerhalb der Poren der Granulat-Partikel, was eine zusätzliche Oberflächenvergrößerung und damit einen Vorteil im Bezug auf die gewünschte Osteokonduktivität darstellt. Der durch Zugabe von PS modifizierte Zement der Gruppe III füllt die Defekte jeweils als kompakter Block. Es können keine Lösungs- und Fragmentierungsprozesse zum Untersuchungszeitpunkt festgestellt werden. Diese Kompaktheit bietet keine Osteokonduktivität und verhinderte die zelluläre Erschließung der Defekte. In der Kontrollgruppe IV sind die Leerdefekte mit Erythrozyten-reicher, Fibrin-dominierter Matrix gefüllt, eine gerichtete Osteogenese findet nicht statt. Bei den Tieren der Gruppe I ist die Knochenneubildung vor allem entlang von Bohrmehloberflächen und entlang von peripher in den Defekten lokalisierten TCP-Fragmenten zu erkennen. Im Hinblick auf die Fremdkörperreaktion kann ein Gradient von der Defektperipherie, mit einer großen Zahl von Polykaryen, bis zum Übergang der Defektmitte in das Defektzentrum, wo nur noch sehr vereinzelt mononukleäre Phagozyten enthalten sind, nachgewiesen werden. Bei den Schafen der Gruppe II prägen bereits deutliche Knochenneubildungs-prozesse das histologische Bild. Knochenbälkchen überbrücken die äußeren Bereiche der Defektmitte und integrieren das Granulat bereits knöchern. Fremdkörperreaktionen sind an Bohrmehlfragmenten in der Defektperipherie und am Knochenersatzstoff in der Defektmitte zu beobachten. Sie schwächen sich bis zum Übergang in das Defektzentrum ab. Dominiert noch am Übergang von der Defektmitte zum Defektzentrum die chronische Entzündung, sind im Defektzentrum noch Anzeichen einer späten akuten Entzündung zu sehen. Das histologische Bild bei den Tieren der Gruppe III (CaP-PS) ist sehr heterogen. Nur zwei Schafe zeigen eine ausgeprägte Fremdkörperreaktion im Bereich der Bohrkante. Ein zelluläres Erschließen der Defekte ist aufgrund der Material-Eigenschaften nicht möglich. Daher konzentriert sich die Fremdkörperreaktion in Form von multinukleären, TRAP-positiven Zellen auf den äußeren Rand des Knochenersatzstoffes sowie auf den Lagerknochen der Defektperipherie nahe der Bohrkante. In diesem Bereich ist auch die Besiedlung des Zementes mit Osteoblasten zu beobachten. In dieser Form ist das mit PS modifizierte Material ausreichend biokompatibel, jedoch muss in weiteren Untersuchungen geklärt werden, ob durch weitere Zusätze wie beispielsweise Coll-I oder eine veränderte Applikationsform (präformiertes Porengefüge) eine ausreichend verbesserte Osteokonduktivität erreicht werden kann. Insgesamt ist das CaP-Granulat dem TCP-Zement im Hinblick auf die Osteokonduktivität und die Osseointegration bei vergleichbarer entzündlicher Antwort deutlich überlegen und sollte, sofern die Applikationsform eines Granulates für die jeweilige chirurgische Fragestellung in Betracht kommt, vorgezogen werden. The aim of this study was to evaluate three CaP based bone graft materials especially regarding foreign body reaction during early stage (ten days) after surgery using critical size drill hole defects in the proximal tibia of sheep.For this purpose two year old black head sheep were divided into four groups and underwent surgery using the left tibia. A medial approach was used to cut a bone cylinder of 12mm diameter and 20mm in depth out of the tibia head. Subsequent the defects of the animals representing the fist group were filled with Tricalcium-Phosphate (TCP) Cement (group I / TCP; n=3), the defects of the animals representing the second group were filled with Calcium-Phosphate (CaP)-Granules (group II / CaP; n=2) and those of the animals forming the third group were filled with a CaP-cement modified with 10 mg/g Phosphoserine (PS) (group III / CaP-PS; n=5). The defect was sealed by a bony slice which has been taken from the extracted cylinder. The animals of the fourth group provide as control, their defects were not filled, but closed with the bony slice. Ten days after surgery, the sheep were sacrificed and the left tibia head was explanted after perfusion.Paraffine sections, sawing-grinding samples and semi-thin sections were used for lightmicroscopical examination. Therefore the specimen were embedded in paraffine, methyl-methacrylate (Technovit T7200, Technovit T9100) and resin (EPON). All samples were stained for histomorphometrical examination (Haematoxylin-Eosin, Toluidin-blue, Safranin O) or exposed to immuno- (CD68/CD44) and enzyme-histochemistry (TRAP), respectively.In order to describe the spatial distribution of the foreign body reaction, the defects were divided into circular areas: the defect periphery includes the outer circle of the host bone around the defect. The border of the host bone represents the beginning of the defect area which has been subdivided into a middle and a central part.Looking at the histological overview, the three bone graft materials differ notably from each other: the TCP-cement used in group I forms fragments in situ. This enables the cells to migrate into the center of the defects. The defects filled with CaP-Granules reveal cells not only along the surfaces of the granule particles but also within the preformed porous system, which causes an increase of the surfaces of the implant material and improves osteoconductivity. The modified cement containing PS used in group III fills the defect as a compact block with tight contact to the osseous border of the host bone. No dissolution or fragmentation processes become obvious at the moment of examination. The compact material does not reveal any signs of osteo-conductivity and prevents cellular migration into the defect areas. Defects of group IV are filled with fibrin-dominated matrix rich in erythrocytes, newly formed bone can not be detected.Looking at the animals of group I, newly formed bone is located around the reaming debris localized next to the host bone and the adjacent TCP-fragments. Concerning the foreign body reaction, there is a gradient which is characterized by a high number of multinucleated giant cells localized within the periphery of the defects. Their number decreases within the middle part of the defects, while in the central part of the area there are only a few mononuclear phagocytes. The animals of group II are characterized by broad osteogenesis. Trabecles of newly formed bone are located in the periphery of the middle areas and osseous integration of CaP granules has already occurred. Foreign body reaction is visible around the debris and the bone graft material localized within the middle defect area. The reaction decreases towards the central area, at the transition between the middle and the central area, signs of chronic inflammation predominate. Later phase of acute inflammation can still be seen in the central areas of the defects.Heterogenous histological features become evident within group III as only two animals reveal distinct signs of the foreign body reaction. Due to the material proper-ties, the absence of cells within the defects is a common feature. Multinucleated, TRAP-stained cells characterizing the foreign body reaction are localized around the outer border of the bone graft material and in close vicinity to the host bone. The cement combined with PS which was used in group III reveals biocompatibility sufficiently without providing for osteoconductivity. Further studies have to elucidate, whether other additives such as Coll I or modification of the structure such as creation of a porous labyrinth can achieve osteoconduction sufficiently. As seen in group II, the CaP Granules are superior to the TCP-cement concerning osteo-conductivity and osseointegration whereas the extent of inflammation is comparable after the use of both bone substitutes. Therefore the use of the CaP-granules should be considered when the use of granules is viable for the surgery which has to be performed.