Durch [Arg8]Vasotocin induzierte Translokation des Wasserkanals Aquaporin-2 im tubulären System der Hühnerniere

Abstract

Das in magnozellulären Kerngebieten des Hypothalamus gebildete und in der Neurohypo-physe gespeicherte antidiuretische Hormon (ADH) bewirkt bei Säugetieren sowie Vögeln eine ausgeprägte renale Antidiurese. Dabei ist bei Säugern sowohl der rezeptive Mechanis-mus in den Hauptzellen der Sammelrohre (G-Protein gekoppelter, 7-transmembranaler V2-Rezeptor), die nachfolgende intrazelluläre Signaltransduktion (cAMP Bildung, Aktivie-rung der Proteinkinase A) sowie die finale Phosphorylierung vesikulär gespeicherter Was-serkanäle (= Aquaporin-2 = AQP-2) und deren Translokation in die luminale Zellmembran eingehend untersucht. Bei Vögeln hingegen konnten zwar die Hauptzellen der Sammel-rohre ebenfalls als wahrscheinlichste Zielstruktur für ADH identifiziert werden. Die mole-kulare Entität des Rezeptors sowie die nachgeschaltete Signaltransduktion hingegen blei-ben bis dato ungeklärt. Hinsichtlich der Bedeutung eines vogelspezifischen AQP-2 liegen erste Daten für die Wachtel, eingeschränkt auch für das Huhn vor.Primäres Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war daher der zelluläre Expressionsnach-weis für den Wasserkanal AQP-2 sowie dessen ADH-induzierte Translokation in die api-kale (bzw. auch laterale) Plasmamembran von Epithelzellen bestimmter Tubulussegmente der Hühnerniere mit Bezug zur Körperflüssigkeitshomöostase. Serielle Gewebsschnitte von in Paraffin eingebetteten Hühnernieren nach transkardialer Perfusionsfixation ermög-lichten zunächst aufgrund einer Hämatoxylin-Eosin Färbung die eindeutige Identifizierung der für die Vogelniere charakteristischen säugerähnlichen sowie reptilienähnlichen Glomerula sowie Epithelien aller tubulären Segmente, wie des proximalen Tubulus, der Henleschen Schleife, des distalen Tubulus sowie corticaler und medullärer Sammelrohre. Für den immunhistochemischen Nachweis des AQP-2 in der Hühnerniere kam ein gegen rattenspezifisches AQP-2 gerichtetes, polyclonales Antiserum in Form affinitätsgereinig-ter IgGs zum Einsatz. Durch indirekte Immunfluoreszenz konnte eine AQP-2 Expression selektiv in der Mehrzahl der Hauptzellen aus den Bereichen des Cortex renalis, corticaler sowie medullärer Sammelrohre, nicht jedoch anderen Zellen bzw. tubulären Komponenten der Hühnerniere aufgezeigt werden. Die Spezifität der Markierung konnte durch Kontroll-versuche (z.B. Absättigen der IgGs mit dem entsprechenden Antigen) untermauert werden. Interkalierende Schaltzellen der Sammelrohre aller drei Nierenbereiche waren durch das Fehlen des AQP-2 Wasserkanals, dafür jedoch ausgeprägte Expression der Carboanhydra-se II charakterisiert, ganz im Sinne ihrer Beteiligung an der Regulation des aviären Säure-Basen Haushaltes.Zur Untersuchung [1] der Translokation des Wasserkanals AQP-2 in die apikale und/oder laterale Plasmamembran der Hauptzellen, [2] einer möglichen Beteiligung von cAMP als second messenger für das vogelspezifische, antidiuretische Hormon [Arg8]Vasotocin = AVT, sowie [3] der Verteilung und Quantifizierung des Rezeptors für AVT in der Hüh-nerniere wurden für jeden dieser drei experimentellen Versuchsansätze drei Gruppen juve-niler Hühner herangezogen. Neben einer euhydrierten Kontrollgruppe (EUH) wurde einer zweiten Tiergruppe zur endogenen Stimulation des AVT-Systems für 40 Std. das Trink-wasser entzogen (DEH); einer dritten Versuchstiergruppe wurde akut für 30 min AVT (5 ng/min/kg KG) systemisch infundiert (AVT). Während die DEH-Hühner gegenüber der EUH-Kontrollgruppe bei extrazellulärer Hypovolämie und Hypernaträmie eine um den Faktor 3 stimulierte AVT Plasmakonzentration aufwiesen, war diese in der AVT-Gruppe bei unveränderten Werten des Extrazellularraumes um das 7-fache erhöht.Die homogene AQP-2 Expression vorrangig im Bereich des supranukleären bis subapika-len Zytosolbereichs der sammelrohrspezifischen Hauptzellen spiegelte die Situation des in Speichervesikeln vorliegenden, ruhenden AQP-2 Wasserkanals bei Tieren der EUH-Gruppe wieder und stellte somit die unstimulierte Ausgangssituation des AQP-2 Translo-kationsprozesses dar. Der Entzug des Trinkwassers (DEH-Gruppe) resultierte in einer sig-nifikanten Zunahme der vesikelassoziierten AQP-2 Expression im gesamten Zytosol der Hauptzellen vor allem im Bereich des Cortex renalis und corticaler Markkegel, weniger der medullären Sammelrohre. Darüber hinaus kam es zu einer Translokation des Wasser-kanals vorrangig in die luminale, in geringem Maße auch die laterale Zellmembran der Epithelzellen. Die systemische AVT-Applikation hingegen resultierte in einer ausgepräg-ten Translokation von AQP-2 primär in die laterale sowie teilweise auch in die luminale Zellmembran. Die Beteiligung intrazellulärer Komponenten des Zytoskeletts sowie von SNARE-Proteinen, sowie die mögliche Funktion einer eher lateralen anstatt rein apikalen AQP-2 Translokation bei akut erhöhten AVT-Plasmakonzentrationen werden diskutiert. Ebenfalls immunhistologische Untersuchungen zu einer möglichen Funktion von cAMP in Rahmen des AVT-induzierten AQP-2 Transfers, durch den Einsatz eines cAMP spezifi-schen Antikörpers, haben keine eindeutigen, eher negative Ergebnisse erbracht. Dieses Ergebnis lässt sich durch zahlreiche Befunde in der Fachliteratur stützen.Die Verwendung des Radioliganden [3H]Vasopressin ermöglichte es, in einer angereicher-ten Plasmamembranfraktion der Hühnerniere mittels Sättigungskinetiken die Affinität (KD) sowie Dichte (Bmax) eines AVT-rezeptiven Systems zu bestimmen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die endogene Stimulation des AVT-ergen Systems (DEH), vor allem aber die exogene Applikation des Nonapeptides (AVT) zu einer Down-Regulation des putativen Rezeptors bei unveränderter Bindungsaffinität führte. Kompetitive Verdrängungsstudien mit AVT-Strukturanaloga sowie Agonisten für bestimmte Subtypen des säugerspezifischen ADH-Rezeptors ergaben eindeutig die höchste Bindungsaffinität für AVT, bei marginaler Affinität für V2-Rezeptor spezifische Analoga. Es konnte nachgewiesen werden, dass der renal exprimierte AVT-Rezeptor des Huhnes unterschiedliche Charakteristika im Ver-gleich zu den V1a-, V1b- oder V2-Rezeptorsubtypen des Säugers aufweist. Die abschließen-de rezeptorautoradiographische Analyse konnte die funktionelle Expression des mit dem Radioliganden markierten Rezeptors im Bereich der reptilienähnlichen Glomerula sowie des Sammelrohrbereichs nachweisen. Eine Aktivierung des vogelspezifischen ADH-Systems führte somit einerseits zu einer moderaten Down-Regulation des entsprechenden, zur Situation beim Säuger jedoch unter-schiedlichen Rezeptorsystems in der Niere des Huhnes; die Beteiligung von cAMP als klassischem second messenger des ADH bei Säugern konnte in den durchgeführten Stu-dien an der Hühnerniere nicht eindeutig geklärt werden. Interessanterweise bewirkte die durch extrazelluläre Dehydratation erhöhte Plasmakonzentration an AVT in erster Linie eine Translokation des Wasserkanals AQP-2 aus seiner vesikelassoziierten, zytosolischen Position primär in die luminale Plasmamembran, wohingegen systemisch verabreichtes AVT zu einer AQP-2 Translokation vornehmlich in die laterale Plasmamembran führte. In both mammalian and avian species, the antidiuretic hormone (ADH) - synthesized in magnocellular neurons of the hypothalamus and stored in the neurohypophysis - induces marked antidiuresis at the level of the kidneys. For mammals, the underlying hormone receptive mechanism in principal cells of nephronal collecting ducts (G-protein coupled, 7-transmembranal receptor), the intracellular signalling pathway involved (cAMP formation, protein kinase A activation) and the final steps of phosphorylation of vesicularly stored water channels = aquaporin-2 = AQP-2 with subsequent cellular translocation to the lumi-nal plasma membrane have been elucidated in detail. With regard to the avian kidney, also principal cells of the cortical and medullary collecting ducts could be identified as the most likely target structure for circulating ADH = [arg8]vasotocin = AVT to exert its action. The molecular entity of the receptor as well as the intracellular signalling pathway remain, however, rather unclear. First data became available recently concerning structure and regulated expression of the water channel AQP-2 in the kidney of the quail, and to a limi-ted extent the chicken.The primary goal of the thesis therefore has been to shed light on the cellular expression pattern of AQP-2 in the chicken kidney, with special emphasis being placed upon the AVT-induced AQP-2 translocation into the luminal and/or lateral plasma membranes of nephronal cells of certain tubular segments concerned with the efferent control of body fluid homeostasis. Serial tissue sections of paraffin-embedded, perfusion-fixed chicken kidneys, after staining with hematoxylin-eosin, enabled the clear identification of both reptilian-type and mammalian-type glomerula, as well as epithelia of all tubular seg-ments including proximal tubules, the loops of Henle, distal tubules and cortical/medullary collecting ducts.Affinity-purified IgGs of a polyclonal rabbit antiserum directed against rat-specific AQP-2 have been employed for the immunohistochemical detection of the water channel in the chicken kidney. Using indirect immunofluorescence, AQP-2 expression could selectively be demonstrated in the majority of principal cells of collecting ducts within the cortex renalis, and both cortical and medullary cone regions. Other cells and tubular structures of the chicken kidney, however, could not be immunolabeled positively. Specificity of label-ing was supported by preincubation of the antibody with the respective antigen. Intercala-ting cells of the collecting ducts within all three segments of the kidney investigated could be characterized by the lack of AQP-2 but marked carboanhydrase II expression. In order to elucidate [1] the translocation process for AQP-2 into the luminal and/or lateral plasma membrane of principal cells, [2] the putative contribution of cAMP as a second messenger for avian-specific AVT, as well as [3] the distribution and quantification of receptors for AVT in the chicken kidney, three groups of juvenile chicken were formed for each of these projects. Besides a euhydrated control group (EUH), drinking water was withdrawn for 40 hrs for a second group of animals, rendering them dehydrated (DEH) with an endogenously activated ADH-system. AVT was acutely applied to a third group of chicken by intravenous infusion (5 ng/min/kg BW) for 30 min (AVT). DEH animals pro-ved to have a 4-fold elevated plasma AVT concentration when compared to the EUH group, under conditions of extracellular hypovolemia and hypernatremia, whereas the AVT group revealed an even 8-fold elevation of plasma AVT at unaltered status of the extracel-lular fluid compartment.The homogeneous AQP-2 expression preferentially in the supranuclear to subapical zone of the principal cells reflected the situation of AQP-2 water channels being stored in cytosolic vesicles, waiting to be called upon stage; this status represents the non-stimu-lated starting condition before ADH-induced AQP-2 translocation. The withdrawal of drin-king water (DEH group) resulted in a significant increase in vesicle-associated AQP-2 expression throughout the cytosol of principal cells localized in the cortex renalis, the cor-tical cones and to a lesser degree the medullary cones. Furthermore, in a major portion of collecting duct epithelial cells, the water channel proteins have been translocated to and into the lumi-nal plasma membrane, with some cells also demonstrating immunolabeling for AQP-2 at the level of the lateral membranes. Systemic AVT infusion on the other hand caused pronounced translocation of water channel proteins into the lateral, partially also luminal plasma membrane sites. The contribution of intracellular cytoskeleton components and SNARE proteins, as well as the putative functionality of lateral rather than luminal AQP-2 membrane insertion under conditions of hyperosmolality and/or elevated plasma AVT con-centration is discussed. Additional immunohistochemical experiments trying to reveal the contribution of cAMP as a classical second messenger within the issue of AVT-induced AQP-2 translocation did not yield unequivocal results or even negative ones, thus supporting data collected over the years speaking against a role of cAMP as an important, AVT-induced messenger molecule in the avian kidney.The application of the radioligand [3H]vasopressin allowed the determination of both the affinity (KD) and density (Bmax) of the AVT receptive system in the chicken kidney, em-ploying an enriched plasma membrane fraction. It could be demonstrated, that the endoge-nous stimulation of the AVT system (DEH group), and even more so the systemic admini-stration of AVT (AVT group) induced a down-regulation of the putative AVT receptor at unaltered binding affinity. Competitive displacement studies with AVT analogues and lig-ands for various ADH receptor subtypes showed highest affinity for AVT to displace [3H]AVP, with only marginal affinity for V2 receptor agonist dDAVP. The renally expressed AVT receptor appears to possess binding characteristics different from classical mammalian V1a-, V1b- and V2-receptors. Receptor autoradiographical analysis led to the specific labelling of reptilian-type glomerula and cortical cone collecting tubules.Activation of the avian-specific ADH (= AVT) system thus resulted in a moderate down-regulation the yet unknown renal AVT receptive system. The contribution of cAMP as a classical second messenger of ADH in mammals could not be clarified in the thesis presen-ted. Extracellular dehydration with elevated plasma AVT levels caused a marked transloca-tion of AQP-2 water channel proteins from its cytosolic, vesicle-associated location prima-rily into the luminal plasma membrane, whereas systemically administered AVT at unalte-red status of the extracellular fluid compartment led to AQP-2 translocation into the lateral plasma membranes.