Charakterisierung der Nichtstrukturproteine des Virus der Klassischen Schweinepest

Abstract

Die Biosynthese der Nichtstrukturproteine des Virus der Klassischen Schweinepest(KSPV) wurde hinsichtlich der Hierarchie und Dynamik der proteolytischen Reifungcharakterisiert. Dabei wurden ein wildtypisches nicht-zytopathogenes Feldvirus sowiezwei zytopathogene Konstrukte untersucht, um einen Bezug zu beschriebenen Daten vomnahe verwandten BVDV zu ermöglichen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:1. Ein GST-NS2-3 Fusionsprotein, ein C-terminales Fragment der NS3-Helikase, einC-terminales Fragment von NS4B und das vollständige NS5A des KSPV wurdenin E. coli exprimiert und mittels Ni2+-Ionen Affinitätschromatographie gereinigt.Nach Immunisierung von Versuchstieren erfolgte die Herstellung undCharakterisierung monoklonale Antikörper (mAbs) gegen diese Proteine.2. Indirekte Immunfluoreszenz-Analysen zeigten eine enge Assoziation aller KSPVNichtstrukturproteine mit den Membranen des endoplasmatischen Retikulums. InImmunoblotanalysen eines zp KSPV Replikons und des nzp KSPV konnten dieVorläufermoleküle NS4-5 und NS2-3, die Prozessierungsintermediate NS5A/B,NS4B-5A und NS4A/B zusammen mit den reifen Nichtstrukturproteinenidentifiziert werden. Außerdem zeigte sich eine zusätzliche interne Prozessierungdes reifen NS3 zwischen der Protease- und Helikasedomäne des Moleküls.3. In nzp KSPV, zp KSPV-JIV und dem zp KSPV Replikon wurde die Prozessierungder Nichtstrukturproteine mittel Immunpräzipitation und pulse chase Analysendargestellt. Während der zp Biotyp des KSPV eine effiziente Generierung allerNichtstrukturproteine zeigt, erfolgt die Reifung dieser Proteine im nzp Biotyp nursehr langsam. Zum Vergleich der Biotypen wurden die Halbwertszeiten derVorläufermoleküle und reifen Produkte bestimmt. In diesen Analysen erwiesensich die reifen Proteine des KSPV als stabil (T1/2: 1,5-4 h). Im zp Biotyp werdendie Vorläufermoleküle schneller umgesetzt (T1/2: 0,5-2,5 h) als die reifenNichtstrukturproteine abgebaut werden, so dass die reifen Proteine in den Zellenakkumulieren. Dagegen erzeugt die langsame Reifung der Vorläufermoleküle imnzp Biotyp (T1/2: 2,5-5,5 h) eine konstante Menge an reifen Nichtstrukturproteinenin den infizierten Zellen. Diese Daten deuten erstmals darauf hin, dass diegesteigerte Expression von NS3 im zp Biotyp eines Pestivirus die Prozessierungder anderen Nichtstrukturproteine beschleunigt. Umgekehrt beschränkt dieverminderte NS2-3 Spaltung in nzp Pestiviren die Aktivität der NS3 Protease undreguliert so die Konzentration der reifen Nichtstrukturproteine. The biosynthesis of Classical swine fever virus (CSFV) nonstructural proteins wascharacterized with regard to hierarchy and dynamics of proteolytic maturation. A wildtypicnon-cytopathogenic isolate and two cytopathogenic CSFV constructs were analysed to allowthe comparison with data about the closely related BVDV. The following results wereachieved:1 A GST-NS2-3 fusion protein, a C-terminal fragment of the NS3 helicase, a Cterminalfragment of NS4B, and the entire NS5A of CSFV were expressed in E.coli und purified by Ni2+ ion affinity chromatography. Following the immunizationof laboratory animals, monoclonal antibodies (mAbs) against these proteins wereproduced and characterized.2 Indirect immunofluorescence experiments showed a tight association of all CSFVnonstructural proteins with membranes of the endoplasmic reticulum. Immunoblotanalyses of a cp CSFV replicon and ncp CSFV led to the identification of NS4-5and NS2-3 precursors, NS5A/B and NS4A/B processing intermediates, and of allmature nonstructural proteins. In addition, a novel internal processing of NS3 wasdetected separating the protease and helicase domains of this molecule.3 The nonstructural protein processing of ncp CSFV, cp CSFV-JIV, and a cp CSFVreplicon was characterized by immunoprecipitation together with pulse chaseanalyses. The nonstructural protein maturation of the ncp biotype of CSFV occursvery slowly, while an efficient generation of all nonstructural proteins takes placein the cp biotype. Half-lives of precursors and mature proteins were determined todirectly compare the different biotypes. These analyses showed that the maturenonstructural proteins of CSFV are stable (T1/2: 1,5-4 h). The maturation ofprecursor molecules was faster (T1/2: 0,5-2,5 h) than the turnover of matureproducts in the cp biotype. In contrast, a constant amount of mature proteins resultsfrom a slow maturation of precursor molecules in the ncp biotype (T1/2: 2,5-5,5 h).These data indicate that enhanced expression of NS3 in cp pestiviruses isresponsible for an accelerated processing of the other nonstructural proteins. Incontrast, inefficient NS2-3 cleavage in ncp pestiviruses restricts NS3 proteaseactivity and thereby regulates the concentration of all mature nonstructuralproteins.