Stoßwelleninduzierte Mechanotransduktion bei humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs)

Abstract

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) verfügen über ein hohes therapeutisches Potential und werden deshalb im Bereich der Transplantationsmedizin eingesetzt. Der therapeutische Erfolg ist jedoch durch die geringe Anzahl vom MSCs, die ihr Zielgebiet erreichen limitiert (Hofmann, et al., 2005). Einer direkten Applikation ins Zielgewebe, stehen die Erkenntnisse von Breitbach et al. entgegen, die am Herzen Ossifikationsprozesse nach intrakardialer MSC-Transplantation zeigen konnten (Breitbach, et al., 2007). Eine Effizienzsteigerung der Therapie könnte über die Verbesserung der Migration von MSCs erfolgen. Dieser Ansatz soll in der vorliegenden Arbeit untersucht werden. Da MSCs eine hohe Sensitivität für mechanische Stimuli zeigen (Friedl, et al., 2007), soll untersucht werden, ob sich das Migrationsverhalten von MSCs mit fokussierter Stoßwelle (SW) und/oder Druckwelle (DW) in vitro beeinflussen lässt. Vorraussetzung dafür ist die Etablierung eines instrumentellen Versuchsaufbaus, der reproduzierbare und vergleichbare SW/DW-Beschallung von MSCs in vitro gewährleistet. Im Fokus stehen dabei die physikalischen Anforderungen des Versuchsaufbaus, die biologischen Ansprüche der Zellen sowie der physiologischen Aspekte der Mechanotransduktion in vitro. Der Hauptfokus der Arbeit liegt in der Untersuchung der Wirkung von SW und DW auf zellbiologische Prozesse, am Beispiel von MSCs. Es sollen Dosiswirkungsspezifische und zeitabhängige Veränderungen der Zellen in Hinblick auf Mechanotransduktion untersucht werden. Das Hauptaugenmerk der Arbeit soll dabei auf der Untersuchung der Veränderung des Aktinzytoskeletts und dem Migrationsverhalten liegen. Für die Untersuchungen wurden piezoelektrisch- und elektromagnetisch generierte SW und ballistische DW (radiale Stoßwelle) eingesetzt und deren zellbiologischen Effekte, zeit- und dosisabhängig verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass sich MSCs signifikant über SW und DW in ihren zellbiologischen Prozessen beeinflussen lassen. Es konnten zeitabhängige Dosiswirkungsbeziehungen festgestellt werden. Diese konnten die zellphysiologischen Vorgänge in verschiedene Richtungen beeinflussen. Die Ergebnisse wurden kumulativ von allen Beschallungsparametern (Energiedichte, Gesamtimpulsanzahl und Frequenz) mit beeinflusst. Die Vergleiche der einzelnen SW-DW-Applikationen ergaben Unterschiede, sowohl in der Breite des Wirkspektrums, als auch im Maß der Effizienz. Des Weiteren ergaben sich bei der Untersuchung der Seneszenz signifikante Erhöhungen bei DW-Applikation, welche bei den untersuchten SW ausblieb. Es kam bei SW-DW-Behandlungen, im Vergleich zu den unbeschallten Kontrollen, zu signifikanten Veränderungen des F-Aktinzytoskeletts und der Migration. Ebenfalls zeigten sich signifikante Veränderungen in der Kinese, sowie der Proliferations- und Apoptoserate von MSCs. Die gezielte Vorbehandlung mit SW/DW kann somit das Migrationsverhalten von MSCs in vitro beeinflussen. Die klinische Relevanz der Arbeit liegt in der möglichen Vorbehandlung von MSCs vor Reimplantation, welches mittels weiterer Untersuchungen, wie Kokultivierungexperimente und Tierversuchsmodellen, überprüft werden müsste. Mesenchymal stem cells (MSCs) have a high therapeutic potential and are therefore used in the field of transplantation medicine. The therapeutic success is limited by the small number of MSCs reaching their target area (Hofmann, et al., 2005). The findings of Breitbach et al., which showed heart ossification processes after intracardiac MSCs transplantation (Breitbach, et al., 2007), discourage a direct application to the target tissue. On the other hand, enhancing MSCs migration may increase the efficiency of the therapy. This approach will be investigated hereby. Given that MSCs display a high sensitivity to mechanical stimuli (Friedl, et al., 2007), we shall examine whether MSCs migration behaviour in vitro can be influenced with focused shock waves (SW) and / or pressure waves (PW). To that end, it will be necessary to establish an instrument experimental setup that guarantees the reproducible and comparable SW / PW-sonication of in vitro MSCs. Special attention should be placed on the physical requirements of the experimental setup, the cell biological constraints, and the physiological aspects of the in vitro mechanical transduction. The main focus of this work is to study the effects of SW and PW on cellular processes, using MSCs as an example. In particular, we shall examine any time-dependent and dose-level specific cell changes induced by mechanical transduction. In this study, we shall primarily concentrate on the analysis of actin cytoskeleton and migratory behaviour changes. Piezoelectric and electro-magnetically generated SW and ballistic PW (radial shock wave) were used in this study, comparing their time and dose-dependent cell biological effects. Amongst our findings, we uncovered that the presence SW and PW has a significant influence on the cell biological processes of the MSCs. Therefore, we managed to establish time-dependent dose-level relationships. These could influence the cell physiological processes in different directions. The results were cumulatively influenced by all acoustic parameters (energy density, total pulse number, and frequency). The comparisons of the individual SW- PW applications showed differences in the activity spectrum width as well as in the degree of efficiency observed. Furthermore, senescence investigations evidenced material increases upon PW application, which were not observed under SW. SW-PW treatments showed significant changes in the f-actin cytoskeleton and migration behaviour compared with non-sonicated treatments. Moreover, significant changes were observed in the kinesis, proliferation, and apoptosis of MSCs. Therefore, the targeted pre- treatment with SW / PW influences the migration behaviour of in vitro MSCs. The clinical relevance of this work lies in the possible pre-treatment of MSCs before re-implantation, which should be reviewed through further investigations including animal studies and co-cultivation experiments.