Untersuchung zur Stärke systemischer und lokaler inflammatorischer Reaktionen bei der Ratte nach Stimulation mit spezifischen Agonisten der endosomalen Toll-like Rezeptoren 7 und 9

Abstract

Hintergrung und Zielsetzung: Toll-like Rezeptoren (TLRs) des angeborenen Immunsystems erkennen konservierte Molekülstrukturen pathogener Mikroorganismen. Die TLRs 7 und 9 sind in Anlehnung an ihre Aufgabe einzelsträngige virale RNA bzw. intrazellulär auftretende bakterielle oder virale DNA zu erkennen, im endosomalen Kompartiment bestimmter Zellen lokalisiert. Die synthetischenTLR 7 bzw. 9 Agonisten Imiquimod und ODN 1668 werden bereits als Immunadjuvantien oder zur topischen Behandlung von Hautkrebserkrankungen eingesetzt. Dem zufolge sind detaillierte Informationen über mögliche Nebenwirkungen dieser Substanzen dringend erforderlich. Daher wurden die Konsequenzen einer lokalen subkutanen (SC) oder systemischen intraperitonealen (IP) Injektion von Imiquimod / ODN 1668 bei Ratten untersucht. Analysiert wurden hierbei die Entstehung von Fieber und Krankheitsverhalten, sowie die periphere und zentralnervöse (hypothalamische) Induktion einer breiten Palette an proinflammatorischen Molekülen. Methodik: Ratten wurden SC (in eine subkutan angelegte Luftblase) oder IP mit Imiquimod/ ODN 1668 in Dosierungen von 1 bzw. 5 mg/kg Körpergewicht behandelt. Körperkerntemperatur, motorische Aktivität sowie Futter- und Trinkwasseraufnahme wurden telemetrisch erfasst und ausgewertet. Periphere und zentralnervöse Bildung proinflammatorischer Moleküle wurden mittels RT-PCR, Bioassays, ELISAs und Immunhistochemie / Immunfluoreszenz experimentell untersucht. Kernbefunde: Bei Imiquimod und ODN 1668 handelt es sich um die bislang ersten diesbezüglich untersuchtenTLR-Agonisten, bei denen sich Fieber und Anorexie in stärkerem Umfang nach lokaler(SC) verglichen mit systemischer (IP) Stimulation manifestieren. Periphere Induktionvon Interferonen (IFNs) und zirkulierende Konzentrationen anderer potentieller endogener Pyrogene (TNFα, IL-6) korrelierten mit der jeweiligen Stärke der untersuchten Krankheitssymptome.Während Imiquimod eine stärkere Kapazität zur Induktion von IFNs, besonders IFNγ, zeigte, verursachte eine Behandlung mit ODN 1668 höhere zirkulierende IL-6-Konzentrationen.Im Gehirn (Hypothalamus) war nach Stimulation mit beiden Substanzen eine erhöhte Expression von Zytokinen (TNFα, IL-1β, IL-6) und den induzierbaren Formen derEnzyme zur Prostaglandin E2-Synthese (COX 2, mPGES) nachweisbar. Dies war von einer moderaten Aktivierung der Transkritionsfaktoren NF-κB und STAT3 und einer starken Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-IL6 begleitet, besonders in Zellen von Hirnregionen mit unvollständiger Blut-Hirn-Schranke und in stärkerem Ausmaß nach SC verglichen mit IP Stimulation der Versuchstiere. Korrelierend zur peripheren Bildung von IFNγ bzw.IL-6, verursachte Imiquimod eine stärkere Aktivierung von NF-IL6, während die IL-6-vermittelte nukleäre Translokation von STAT3 nach Behandlung mit ODN 1668 stärker ausfiel. Schlussfolgerungen: Selbst bei Einsatz vergleichsweise hoher Dosierungen verursacht eine Behandlung mit den endosomalen TLR 7 / 9-Agonisten Imiquimod und ODN 1668 nur moderate ZNS-kontrollierte Krankheitssymptome. Diese scheinen in Zusammenhang mit peripherer Bildungvon IFNγ / IL-6 zu stehen und werden möglicherweise durch eine Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-IL6 / STAT3 verursacht, die wiederum für eine intrahypothalamische Bildung eines Cocktails proinflammatorischer Mediatoren verantwortlich sind. Verglichen mit anderen TLR-Agonisten, sind die Krankheitssymptome, die nach SC oder IP Behandlung mit Imiquimod entstehen als relativ schwach einzustufen. Das völlige Fehlen einesseptischen Zustands nach Gabe von Imiqumid oder ODN 1668 lässt die therapeutische Einsetzbarkeit beider Substanzen als relativ unbedenklich erscheinen. Background and purpose: Toll-like receptors (TLRs) of the innate immune system recognize conserved molecular patterns associated with microbial pathogens. TLRs 7 and 9 are located in the endosomal compartments due to their task to sense single stranded viral RNA (TLR 7) or intracellular bacterial or viral CpG-DNA. The synthetic TLR 7 and TLR 9 agonist imiquimod and ODN 1668 are used as immuoadjuvants or for topical treatment of skin cancers. Accordingto these circumstances detailed information about possible side effects of these drugs are warranted. Therefore, the consequences of local subcutaneous (SC) or systemic intraperitoneal(IP) injections of imiquimod / ODN 1668 on the manifestation of fever, sickness behaviour,and the peripheral and brain-intrinsic induction of a variety of inflammatory molecules were investigated in rats. Experimental approach: Rats were given SC (subcutaneous airpouch) or IP imiquimod / ODN 1668(1 or 5 mg.kg-1). Body temperature, motor activity, food and water intake were recorded by telemetric devices. Peripheral and brain-intrinsic (hypothalamic) induction of inflammatory mediators was analyzed by RT-PCR, bioassays, ELISAs and immunohistochemistry / immunofluorescence. Key result: SImiquimod and ODN 1668 are the first TLR-agonist investigated, which have stronger effectson fever and anorexia after its SC as compared to IP administration. Peripheral induction of interferons (IFNs) and putative circulating pyrogens (TNF, IL-6) corresponded to the strength of the illness responses. While imiquimod showed stronger capacities to induce IFNs, namely IFNγ, ODN 1668 induced higher levels of circulating IL-6. In the brain (hypothalamus), an expression of cytokines (TNFα , IL-1β, and IL-6) and inducible forms of enzymes for prostaglandin E2 synthesis (COX 2, mPGES) occurred, which was accompanied by a moderate activation of the transcription factors NF-κB and STAT3 and astrong activation of the transcription factor NF-IL6, namely in cells of specific sites with an open blood-brain barrier, again to a higher degree in SC treated rats. Corresponding to the peripheral induction of IFNγ and / or IL-6, imiquimod caused stronger activation of NF-IL6,while the IL-6 mediated nuclear translocation of STAT3 was more pronounced in responseto ODN 1668. Conclusions and implications: Even when given at a high dose, imiquimod and ODN 1668 cause rather moderate braininflammatory responses, which are related to peripheral IFN / IL-6-expression and possibly mediated by brain-intrinsic activation of NF-IL6 / STAT3 and the induction of a proinflammatory cocktail within the hypothalamus. Compared to other TLR-agonists, brain-controlled illness responses are rather moderate after SC or IP treatment of rats with imiquimod or ODN 1668. The lack of a septic state in imiquimod or ODN 1668-treated rats reinforces therapeutic use of these drugs.