The influence of hypoxia, strain and growth differentiation factors on equine adipose tissue derived mesenchymal stem cells : a study to improve stem cell differentiation in vitro for their future application in vivo

Abstract

Oxygen tension is an important factor for stem cell culture and differentiation. Since in vivo conditions are mostly hypoxic, but in vitro conditions are generally normoxic, the goal of this study was to examine and compare equine ASCs behaviour and differentiation potential under hypoxic (3% O2) and normoxic (21% O2) conditions. Examined was the differentiation potential towards the adipogenic, osteogenic, chondrogenic and tenogenic lineage, with a special interest and focus on the tenogenic differentiation, since tendon injuries are one of the most common lameness reason in the horse and lack of satisfying treatment options at the same time.While the expression of characteristic stem cell markers did not vary under normoxic or hypoxic culture conditions, the cell proliferation as determined by the MTT assay was higher under normoxic conditions. We were also able to show that adipogenesis and chondrogenesis revealed better histological differentiation results under hypoxic conditions, while osteogenesis was more effective under normoxic culture conditions.For the tenogenic differentiation potential not only the influence of oxygen tension, but also the influence of a 3d collagen scaffold, applied uniaxial tensile strain and supplementation of growth differentiation factors, namely GDF 5, GDF 6, GDF 7, respectively a combination of those three factors was examined in a combined in vitro experiment. Immunohistochemistry revealed that all ASCs of the differently treated collagen constructs formed cell to cell contacts and developed a 3d network in the scaffold. Furthermore it could be demonstrated that tensile strain is necessary to reach matrix stiffness, tendon-typical cell morphology and a coordinated cell alignment in the scaffold. By electron microscopy it could be shown that the examined cell morphology was more tendon-typical under an oxygen tension of 21%, while the gene expression of the tendon relevant markers Col I, Col III, COMP and Scx revealed no big differences under the compared oxygen tensions, even though the results under normoxic conditions were more stable. Compared with equine tendon, the gene expression of Col I and Col III was higher in the samples of the in vitro engineered tendon-like cells, but the gene expression of COMP and Scx was distinct lower. A supplementation of the medium with GDFs, especially GDF 5 and GDF 7 improved the cell morphology and the gene expression. Surprisingly we could show that alone the usage of the 3d collagen scaffold helped to drive the stem cell differentiation towards the tenogenic lineage. An expression of all four examined genes could be detected, even though the gene expression of COMP and Scx was very low. At the end of the pre-differentiation experiment the cells emigrated the collagen construct after taking the scaffold out of the bioreactor and placing it in DMEM. This way, the pre-differentiated cells can be harvested and used for in vivo application. Hopes are, that the in vivo application of in vitro pre-differentiated tenocyte-like cells lead to faster and better tendon repair, if not regeneration compared with the usage of undifferentiated ASCs. Der Sauerstoffgehalt ist ein wichtiger Faktor für die Anzucht und Differenzierung von Stammzellen. Da die in vivo Bedingungen überwiegend hypoxisch, die in vitro Bedingungen aber in der Regel normoxisch sind, war das Ziel dieser Arbeit das Verhalten und das Differenzierungspotenzial equiner, adipogener Stammzellen bei hypoxischen (3% O2) und normoxischen (21% O2) Bedingungen zu untersuchen und zu vergleichen. Untersucht wurde das adipogene, osteogene, chondrogene und tenogene Differenzierungspotenzial, mit besonderem Augenmerk auf die tenogene Differenzierung, da Sehnenverletzungen eine der häufigsten Lahmheitsursachen des Pferdes sind und zudem keine zufriedenstellenden Behandlungsoptionen existieren.Während die Expression stammzellcharakteristischer Marker sich bei den unterschiedlichen Sauerstoffgehalten nicht unterschied, war die im MTT Test gemessene Zellproliferation unter normoxischen Bedingungen höher. Weiterhin konnten wir zeigen, dass die Adipogenese und die Chondrogenese bessere histologische Ergebnisse bei hypoxischen Bedingungen aufwiesen, während die Osteogenese bei normoxischen Bedingungen effektiver war.Um das tenogene Differenzierungspotenzial zu untersuchen wurde nicht nur der Sauerstoffgehalt, sondern auch der Einfluss eines 3d Kollagengels, uniaxialer Dehnung und die Verwendung von Wachstumsfaktoren, namentlich GDF 5, GDF 6, GDF 7 und einer Kombination aus den dreien in einem kombinierten in vitro Experiment untersucht.Die Ergebnisse der Immunhistochemie zeigten, dass alle ASCs der unterschiedlich behandelten Gel-Konstrukte Zell-zu-Zell Kontakte ausbildeten und ein 3d Netzwerk in der Matrix formten. Weiterhin konnte demonstriert werden, dass ein Dehnungsreiz notwendig ist, um eine gewisse Matrixsteifheit, eine sehnentypische Zellmorphologie und eine koordinierte Zellausrichtung im Gel zu erreichen. Mit Hilfe der Elektronenmikroskopie konnte gezeigt werden, dass eine für Sehnen typischere Zellmorphologie bei einem Sauerstoffgehalt von 21% erreicht werden kann, während die Genexpression der sehnenrelevanten Marker Kollagen I, Kollagen III, COMP und Scleraxis unter den zwei verschiedenen Sauerstoffgehalten keinen wesentlichen Unterschied aufwies. Verglichen mit der Pferdesehne war die Expression von Kollagen I und Kollagen III in den in der Zellkultur gezüchteten Sehnenzellen höher, aber die Expression von COMP und Scleraxis war deutlich niedriger. Die Zugabe der Wachstumsfaktoren zum Medium, insbesondere von GDF 5 und GDF 7 verbesserten Zellmorphologie und Genexpression. Wir konnten zeigen, dass überraschenderweise allein die Verwendung der 3d Matrix in gewissem Masse zur Differenzierung in die tenogene Richtung führte. Die Expression aller vier untersuchten Gene konnte nachgewiesen werden, auch wenn die Expression von COMP und Scleraxis sehr gering war.Am Ende des Differenzierungsversuches emigrierten die Zellen aus der Kollagenmatrix, nachdem sie aus dem Bioreaktor herausgenommen und in eine Schale mit DMEM gelegt wurden. Auf diese Weise können die vordifferenzierten sehnenähnlichen Zellen geerntet und für in vivo Versuche verwendet werden. Es besteht die Hoffnung, dass die in vivo Anwendung von in vitro vordifferenzierten sehnenähnlichen Zellen zu schnelleren und besseren Heilungsergebnissen, falls nicht sogar zur vollständigen Regeneration bei Sehnenverletzungen führt.