Demyelinisierung und Axonschaden in der MOG35-55-induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis der C57BL/6-Maus : eine ultrastrukturelle Studie

Abstract

Die Multiple Sklerose (MS) gilt als Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) und ist durch multizentrische Inflammation, Demyelinisierung und Axonschädigung charakterisiert. Trotz großer Forschungsanstrengungen bleiben die zugrunde liegenden Pathomechanismen unverstanden. Die Untersuchung pathogenetischer Mechanismen am Menschen ist mit großen Schwierigkeiten verbunden, daher sind Tiermodelle auch heute noch unerlässlich, um grundlegende Mechanismen der Läsionsentstehung im ZNS verstehen und die Läsionsformation über die Zeit verfolgen zu können. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis ist eines der am häufigsten verwendeten Modelle der MS. Insbesondere der C57BL/6 (B6)-Mausstamm ist für mechanistische Studien unabdingbar, da viele genmodifizierte Mäuse auf diesem Hintergrund gezüchtet werden. Eines der traditionellen Modelle der B6-EAE ist die Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein Peptid 35-55 (MOG35-55)-induzierte EAE. Aufgrund der Ähnlichkeit der histopathologischen Charakteristika der MOG35-55-induzierten EAE mit der menschlichen Erkrankung und aufgrund der einfachen Verfügbarkeit und Herstellbarkeit des MOG35-55 stellt dieses Modell eines der am häufigsten verwendeten MS-Modelle dar. Bevor jedoch die pathogenetische und/oder therapeutische Bedeutung einzelner Effektormechanismen evaluiert werden kann, bedarf es einer eingehenden Charakterisierung des verwendeten Modells.Verschiedene Arbeitsgruppen haben die inflammatorische Komponente der MOG35-55-induzierten EAE untersucht und auch die Rolle neurodegenerativer Prozesse wurde, unter anderem von unserer Arbeitsgruppe, in lichtmikroskopischen und immunhistochemischen Studien bereits evaluiert. Die vorliegende Arbeit ist die erste Studie, die eine Charakterisierung der Myelin- und Axonpathologien in der MOG35-55-induzierten EAE auf ultrastruktureller Ebene vornimmt. Um die Histopathologie der MOG35-55-induzierten EAE der B6-Maus über einen Zeitraum von sechs Monaten untersuchen zu können, wurden eindeutige morphologische Korrelate einer Myelin- und Axonschädigung herangezogen, um zeitabhängige Unterschiede und/oder Ähnlichkeiten zwischen der akuten, chronischen und langzeit-chronischen Phase der EAE zu beurteilen. Für diesen Zweck wurden Querschnitte des lumbalen Rückenmarks MOG35-55-immunisierter Mäuse zum Zeitpunkt der akuten EAE (erstes Auftreten der paralytischen Symptome), drei Monate (chronische EAE) und sechs Monate nach Krankheitsbeginn (langzeit-chronische EAE) angefertigt, in EPON eingebettet und mittels Elektronenmikroskopie untersucht.Das Ausmaß der Myelinpathologie wurde mittels Messung der g-ratio (Axondurchmesser geteilt durch Gesamtdurchmesser der Nervenfaser) evaluiert und nahm zeitlich progredient zu. Eine Schädigung der Axone hingegen konnte bereits früh im Krankheitsverlauf vermehrt nachgewiesen werden und blieb über den beobachteten Zeitraum von sechs Monaten konstant erhöht. Als axonale Pathologien wurden axonaler Verlust, Axolyse, eine Vergrößerung der axonalen Mitochondrien sowie eine Verringerung im Abstand benachbarter Neurofilamente im Axon (NNND) gewertet. In Übereinstimmung mit der Situation beim MS-Patienten zeigt diese Erkenntnis eindrücklich die Bedeutung des axonalen Schadens als morphologisch-strukturelles Korrelat irreversibler klinischer Schäden auf, entsprechend dem chronischen Krankheitsverlauf in diesem Modell. Weiterhin konnten wir bereits früh im Krankheitsverlauf das Auftreten einer isolierten Axonschädigung ohne gleichzeitige Pathologie der Myelinscheide nachweisen. Diese Beobachtung zeigt, dass eine axonale Schädigung, zumindest teilweise, auch in Abwesenheit von Myelinpathologien auftreten kann. Dies bestärkt die Notwendigkeit, auch neuroprotektive Therapiestrategien zu entwickeln und damit die immunmodulierende Basistherapie zu ergänzen. Auch das Auftreten regenerativer Prozesse, d. h. eine Remyelinisierung der zuvor demyelinisierten Myelinscheide, konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen und als Charakterisitikum der langzeit-chronischen EAE identifiziert werden. Bei der Auswertung der Myelin- und Axonpathologien wurde zur Evaluation der Traktspezifität stets zwischen Ventrolateral- und Dorsalstrang unterschieden, wobei insgesamt für die beiden untersuchten Bahnsysteme eine völlig unterschiedliche Läsionskinetik gefunden werden konnte. Neben der Untersuchung der Läsionsregion der weißen Substanz wurde in der vorliegenden Studie auch die lichtmikroskopisch normal erscheinende weiße Substanz (normal-appearing white matter, NAWM) evaluiert. In dieser Region konnten wir im Gegensatz zu Kontrollgewebe vermehrt Myelin- und Axonpathologien nachweisen, das Ausmaß der Pathologie lag zwischen Kontrollgewebe und Läsionsregion. Ingesamt legen die Ergebnisse der vorliegenden Studie nahe, dass die histopathologischen Charakteristika der MOG35-55-induzierten EAE der B6-Maus viele Aspekte der MS Pathologie widerspiegeln und dieses Modell daher besonders gut für mechanistische Studien über den Einfluß sowohl neuroprotektiv als auch neurodegenerativ wirkender Mechanismen in autoimmunen ZNS-Erkrankungen geeignet ist. The human disease multiple sclerosis (MS) is considered to be an autoimmune disorder characterized by multicentric central nervous system (CNS) inflammation, demyelination and axonal pathology. Despite tremendous scientific effort, the underlying pathomechanisms still remain to be elucidated. Since mechanistic studies are difficult to carry out in humans, MS research is still largely dependent on suitable animal models to investigate the patterns and kinetics of lesion formation in the CNS. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) has been studied for decades as an animal model for MS. In particular the C57BL/6 (B6) strain is gaining increasing importance since most gene-modified mice are on this background and are needed for mechanism-oriented studies. One of the traditional models in B6 mice is myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)-induced EAE. The histopathological features of MOG35-55-induced EAE closely mirror the hallmarks of the human disease. Along with the easy availability and producibility of MOG35-55, this renders MOG35-55-induced EAE one of the most commonly used animal models of MS. However, an in-depth characterization of the employed model is a prerequisite for such downstream mechanistic studies on the pathogenetic and/or therapeutic impact of single effector pathways and molecules. Various studies have dealt with the inflammatory component of MOG35-55-induced EAE and among others our group has previously investigated the role of neurodegenerative processes in lightmicroscopic and immunhistochemical studies. However, the present study is the first to evaluate the patterns of demyelination and axonal pathology of MOG35-55-induced EAE on the ultrastructural level. Using distinct morphologic correlates of myelin and axonal damage, we assessed the histopathology of MOG35-55-induced EAE in B6 mice over the course of time to determine the stage-dependent differences and/or similarities between acute, chronic and long-term chronic stages of the disease. For this purpose, transverse segments of the lumbar spinal cord of MOG35-55-immunized mice were obtained at the peak of acute EAE, three months after EAE onset (chronic EAE) and six months after the first day of paralytic symptoms (long-term chronic EAE), EPON-embedded and evaluated by electron microscopy. The extent of myelin pathology in CNS lesions was evaluated by measurement of the g-ratio (axon diameter divided by nerve fiber diameter) and increased progressively over the course of time. Conversely, axonal pathology was present already at disease onset and could be observed constantly in the chronic stages of the disease. Features of axonal damage covered axonal loss, axolysis, mitochondrial swelling and decrease in nearest neighbour neurofilament distance (NNND). This renders axonal damage the morphologic-structural correlate of irreversible clinical impairment, strongly supporting the concept that has been proposed for MS patients. Furthermore, we were able to show the occurrence of isolated axonal damage without concurrent myelin damage already early on in the disease course, a finding which demonstrates that axonal pathology can occur, at least partly, independently of myelin pathology. These data clearly point towards the need for alternative therapeutic strageties that are not only immune modulatory, but also neuroprotective. Another finding was the observation that regeneration of the myelin sheath, i.e. remyelination of previously demyelinated nerve fibers, is a consistent feature of the long-term chronic stage of MOG35-55-induced EAE. We also evaluated the tract-specificity of myelin and axonal damage investigating the ventrolateral and dorsal column. Our data demonstrate striking differences in the kinetics of lesion pathology between the two tract systems. Besides the assessment of CNS white matter lesions, we also evaluated the extent of neurodegeneration in the so-called normal-appearing white matter (NAWM). Here, we were able to show an increase in myelin and axonal pathologies compared to control tissue, ranging between the extent of pathology in control tissue and white matter lesions.In sum, our ultrastructural analysis revealed that the histopathologic features of MOG35-55-induced EAE in B6 mice closely mirror many facets of MS pathology and that this model is ideally suited for mechanistic studies on the impact of both neuroprotective and neurodegenerative mechanisms in autoimmune CNS diseases.