Versuche zur Entwicklung eines kompetitiven ELISAs zum Nachweis des pestiviralen Core-Proteins

Abstract

Markervakzinen in der Tiermedizin beruhen auf der Änderung oder Deletion antigenetisch dominanter Bereiche eines Virus, um zwischen der Antikörperbildung nach Impfung und Infektion unterscheiden zu können. Für die klassische Schweinepest (KSP) ist es gelungen, einen potentiellen Markerimpfstoff durch Deletion des Core-Gens zu entwickeln (Riedel et al., 2012). Das Core-Protein ist Teil des viralen Nukleokapsids, das die innere Struktur des behüllten Viruspartikels bildet. Die Charakterisierung von KSPVdeltaCore ergab einen vollständigen Verlust der Virulenz mit der Induktion einer protektiven Immunreaktion. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Immunisierung mit KSPVdeltaCore eine nachweisbare serologische Differenzierung von einer Infektion mit Wildtyp KSPV erlaubt. Auf der Grundlage von früheren Arbeiten war bekannt, dass nur geringe Titer anti-Core spezifischer Antikörper zu erwarten waren. Deshalb wurde als sensitives Nachweissystem ein kompetitiver ELISA entwickelt, der Aussagen über die grundsätzliche Eignung des Core-Proteins als Marker zulässt. Als Testantigen wurde bakteriell erzeugtes, hochgereinigtes Core-Protein zur Beschichtung der ELISA-Platte verwendet. In systematischen Untersuchungen wurde aus 8 monoklonalen anti-KSPV-Core-Antikörpern (Dissertation Gleyder Roman-Sosa) der Antikörper C2 als bestreagierender Detektionsantikörper ausgewählt. Als Positiv-Kontrolle diente das Serum eines Schweines, das mit 50µg nicht adjuviertem Core-Protein immunisiert wurde. Als Negativkontrollen dienten Seren ungeimpfter, nicht infizierter Schweine. 5 KSPV C-Stamm-geimpfte und 8 KSPVdeltaCore-geimpfte Tiere wurden untersucht. Bei Verwendung der jeweiligen Präimmunseren war ein Anstieg der anti-Core Aktivität nach Immunisierung mit KSPV C-Stamm messbar. Diese nachweisbare, aber schwache spezifische Reaktion gegen das Core-Protein wurde durch die starke Hintergrundreaktivität fremder Negativseren überlagert. Eine Reihe methodischer Veränderungen führte zwar zu einer Steigerung der prozentualen Inhibition, erbrachte jedoch keine ausreichende Trennschärfe zwischen ungeimpften oder KSPVdeltaCore-geimpften Tieren im Vergleich zu Schweinen, die mit KSPV C-Stamm immunisiert und/oder virulentem KSPV Koslov infiziert worden sind. Auch wenn diese Arbeit noch keinen brauchbaren diagnostischen ELISA als Ergebnis vorweisen kann, ist sie ein wichtiger Wegweiser für zukünftige Entwicklungen, die zum Ziel haben, die Hintergrundreaktivität der Negativseren zu reduzieren und die Sensitivität des ELISAs zu steigern. Marker-vaccines are based on the change or deletion of domains of a virus, that are antigenetically dominant, with the intention to differentiate between the generation of antibodies after immunization and infection. A potential marker-vaccine for Classical Swine Fever (CSF) was proposed that is based on the deletion of the Core-gene (Riedel et al., 2012). The Core-protein is part of the viral nucleocapsid, which forms the inner structure of the enveloped virus particle. The characterization of the CSFVdeltaCore showed a complete absence of virulence with the induction of a protective immunreaction. Subject of this thesis is to analyze if the immunization of pigs with CSFVdeltaCore enables a detectable serological differentiation to an infection with wildtype CSFV. Preliminary experiments had indicated that only low titres of specific anti-Core antibodies can be expected. Thus, a sensitive competitive ELISA was developed, that allows a statement about the general suitability of the Core-protein as a serological marker. A bacterial expressed, highly purified Core-Protein was used as an antigen to coat the ELISA-plate. Systematic analysis leaded to the choice of the antibody C2 as the best reacting antibody out of 8 monoclonal anti-CSFV-Core-antibodies (dissertation Gleyder Roman-Sosa). The serum of a swine that was immunized with 50µg not-adjuvanted Core-protein served as a positive control. As negative controls sera of unvaccinated and not infected swine were used. Sera of 5 CSFV C-strain-vaccinated and 8 CSFVdeltaCore-vaccinated animals werde analyzed. By the use of the respective preimmunsera an increase of the anti-Core activity after immunization with the CSFV C-strain was measurable. This detecable, but low reaction against the Core-protein was overruled by a strong background reactivity of the negativ sera. Systematic variations of the method resulted in an increase of the percental inhibition but didn t provide a sufficient separation effect between unvaccinated or CSFVdeltaCore-vaccinated animals compared to swine that were immunized with CSFV C-strain and/or infected with CSFV Koslov. This thesis does not provide a suitable diagnostic ELISA for differentiation of Core containing and Core lacking CSF, it can act as an important guide for prospective developments which are primarily aimed at reducing the background reactivity of the negative sera and increasing the sensitivity of the ELISA.