Untersuchungen zum Einfluss von Shigatoxin auf Makrophagen und dendritische Zellen des Rindes

Abstract

Shigatoxin bildende Escherichia coli (STEC) sind in der globalen Rinderpopulation weit verbreitet. Nur selten treten Krankheitserscheinungen auf. Infizieren sich dagegen Menschen, zum Beispiel über kontaminierte Lebensmittel, Getränke oder den Kontakt zu infizierten Tieren, können STEC schwerwiegende Erkrankungen verursachen. Der wichtigste Virulenzfaktor dieser Erreger ist das namensgebende Shigatoxin (Stx). Mø und DC sind im Verlauf der Immunantwort die ersten Immunzellen, die das Eindringen von Pathogenen erkennen und bekämpfen. In der Pathogenese der humanen Erkrankung spielt die pro-inflammatorische Reaktion von Mø auf Stx eine entscheidende Rolle. In dieser Studie wurde die Hypothese aufgestellt, dass STEC bei Rindern über ihre Wirkung auf Mø das Immunsystem modulieren und eine stark inflammatorische Reaktion verhindern.Zunächst wurde daher überprüft, ob die betreffenden Zellen den Rezeptor für das Stx (CD77) exprimieren und welche Veränderungen ihres Phänotyps und ihrer Funktion unter Einfluss von gereinigtem Stx1 beobachtet werden können. Dazu wurde die Wirkung von Stx1 auf primäre bovine Mø und DCs mittels Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie, reverser Real Time PCR und eines IL-10 ELISAs untersucht.In den aus Blutmonozyten generierten Kulturen primärer boviner Mø, lag der Anteil der den Stx-Rezeptor CD77 tragenden nativen Zellen im Mittel bei 32 %. In fixierten und permeabilisierten Zellen, wurde der Rezeptor im Mittel in 84 % der Zellen nachgewiesen. In Bindungsversuchen mit der rekombinanten B-Untereinheit (rStxB) des Toxins, band diese je nach eingesetzter Konzentration an 30 50 % der nativen Zellen. In primären bovinen DCs konnte keine CD77-Rezeptorexpression beobachtet werden. Die Vitalität der Mø wurde durch die Inkubation mit Stx1 signifikant beeinträchtigt. Nach mehr als 24 Transkriptionsaktivität für die Zytokin- und Chemokingene il-4, il-6, il-10, ifn-γ, tnf-α, il-8 und gro-α stieg gegenüber dem Kontrollansatz mit Stx1 plus neutralisierendem Antikörper signifikant an. In den im ELISA untersuchten Zellkulturüberständen der mit Stx1 inkubierten Zellen konnte, trotz der erhöhten Transkriptionsaktivität für il-10, keine erhöhte Konzentration an IL-10 Protein im Vergleich zur Mediumkontrolle nachgewiesen werden.Bovine Mø exprimieren Stx-Rezeptoren, die bei bovinen DCs zu fehlen scheinen. Stx1 ist zytotoxisch für bovine Mø und verändert sowohl die Expression von Oberflächenantigenen, als auch die Transkriptionsaktivität für verschiedene Zyto- und Chemokingene. Bovine Mø, nicht jedoch DCs konnten somit als Zielzellen für Stx1 identifiziert werden. Mø spielen damit wahrscheinlich nicht nur im Verlauf der humanen sondern auch der bovinen STEC-Infektion jeweils eine entscheidende, jedoch gegensätzliche Rolle. Während die Reaktion der Mø auf das Toxin bei der humanen Infektion pro-inflammatorisch geprägt ist, ist die Reaktion bei der bovinen Infektion eher anti-inflammatorisch. Diese Ergebnisse sind damit ein weiterer Schritt zum Verständnis der Wirtsadaptation von STEC an ihren Reservoirwirt Rind. Shigatoxin-producing Escherichia coli (STEC) are widespread in the cattle population worldwide but clinical symptoms caused by STEC are sparse in bovines. By contrast, human STEC infections, e.g. caused by consumption of contaminated food, beverages or contact with infected animals, may lead to severe clinical sequelae. The most important STEC virulence factor is the eponymous Shigatoxin (Stx). Macrophages (Mø) and dendritic cells (DC) are the first line of defense against invading pathogens. Stx-induced pro-inflammatory responses of Mø are central during the pathogenesis of human disease. In this study, we hypothesized that STEC also modulate the cattle immune system by acting on Mø and DC. After testing whether bovine Mø and DCs express CD77, the receptor for Stx, further studies were conducted aiming at unveiling alterations in cellular phenotype and function upon incubation with purified Stx1. To this end, flow cytometry, immune fluorescence microscopy, reverse real time PCR, and IL-10 ELISA were deployed. By average 32 % of native primary bovine Mø expressed CD77. In fixed and permeabilized cells an average of 84% of cells stained positive for CD77. The recombinant B-subunit of the toxin (rStxB1) bound to 30 50 % of native cells. Bovine primary DCs showed no CD77-expression. Mø vitality was significantly impaired by Stx1. Beginning 24 h after addition of Stx1 to the cultures, a distinct cytopathic effect was visible by light microscopy. In CD77-positive Mø Stx1 considerable altered the expression of surface antigens. Expression of CD14, CD172a and the costimulatory molecules CD80 and CD86 was significantly downregulated after 4 h of incubation with Stx1 while MHC II expression remained unaffected. Surface antigens on DCs appeared unaltered by Stx1. Mø phagocytosis was also affected by the toxin. Stx1 modified the transcriptional activity for different cyto- and chemokine genes. The number of transcripts for il-4, il-6, il-10, ifn-γ, tnf-α, il-8 and gro-α increased significantly. Despite enhanced il-10 transcription no elevated levels of IL-10 protein were detectable in culture supernatants of Stx1 challenged Mø, as compared to medium control. The results illustrate that bovine Mø express CD77, which apparently is lacking on bovine DCs. Stx1 was cytotoxic for bovine Mø and altered the expression patterns of surface antigens as well as the cyto- and chemokine transcription profile. Bovine Mø must thus be considered target cells for Stx. Consequently, Mø play a central but opposite role in bovine and human STEC infection. While the immune response of Mø to Stx is pro-inflammatory in humans, Stx-induced effects in bovine Mø are primarily antinflammatory. These findings strengthen our understanding of the way STEC have adopted a commensal-like lifestyle in their reservoir host.