Einfluss der von Exophiala dermatitidis synthetisierten Pigmente auf das Phagozytoseverhalten humaner neutrophiler Granulozyten : Eine explorative Studie am Durchflusszytometer

Abstract

In der vorliegenden explorativen Studie am Durchflusszytometer wurde der Einfluss der von Exophiala dermatitidis synthetisierten Pigmente auf das Phagozytoseverhalten humaner neutrophiler Granulozyten im Vollblutansatz untersucht.Basierend auf den Beobachtungen von Mayser et al. (1998), dass der Hefepilz Malassezia furfur auf einem Minimalagar, dem alleinig Tryptophan als Stickstoffquelle zugesetzt war, unterschiedliche Indolderivate zu bilden vermochte, wurde mittlerweile bei diversen, auch phylogenetisch weit voneinander entfernten Pilzen- wie beispielsweise Exophiala dermatitidis- die Fähigkeit zur Pigmentsynthese beschrieben (Nies 2006; Mayser et al. 2007; Heidrich 2010). Diese Untersuchungen führten zur Aufklärung einiger bis dato noch unbekannter Mechanismen, die im Rahmen der Pathogenese von Infektionen durch derartige Pilze von Bedeutung sein können. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den möglichen Einfluss der von zwei Exophiala dermatitidis-Stämmen gebildeten Tryptophanstoffwechselpigmente auf die Phagozytose zu untersuchen und damit Einblicke in ihre eventuelle pathogenetische Wirkung zu bekommen.Dazu wurden der Wildtyp von Exophiala dermatitidis und seine Melaninmangelmutante Mel-3 zur Pigmentinduktion auf 1b-Agar verbracht. Nach der vierwöchigen Inkubation wurden die Pigmente in Form von Rohextrakt aus dem Agar gelöst. Anschließend erfolgte deren Aufreinigung via Säulen- und Dünnschichtchromatographie. Das von Schnitzler et al. bereits 1999 eruierte Protokoll zur Phagozytoseuntersuchung im Vollblutansatz wurde stark modifiziert, um den Fragestellungen dieser Studie gerecht zu werden. So wurden die Granulozyten zusätzlich mit einem CD16+-APC-Antikörper markiert, um sie bei den Messungen im Durchflusszytometer detektieren zu können. Eine Hemmung der Phagozytoseleistung der Granulozyten durch die protektive Wirkung des in der Zellwand des Wildtyps eingelagerten Melanins konnte im Vergleich zu seiner Mutante Mel-3 in einem Vorversuch festgestellt werden.Es konnte gezeigt werden, dass der Einsatz von DMSO als Lösungsvermittler für den Rohextrakt bereits per se eine inhibitorische Wirkung auf die Phagozytose entfaltet. Weiterführende Messserien mit gepoolten, in Methanol gelösten Sephadex-Fraktionen beider Stämme ergaben, dass die des Wildtyps nicht zu einer signifikanten Hemmung der Phagozytose führen. Bei der Melaninmangelmutante Mel-3 zeigten die gepoolten Fraktionen 1 bis 3 bereits nach 10-minütiger Inkubationszeit eine signifikante Hemmung der Phagozytose. Nach Vereinzelung der drei Fraktionen konnte Fraktion 2 für diese Hemmung verantwortlich gemacht werden. Mittels Dünnschichtchromatographie der Fraktion 2 wurde eine Aufteilung infünf Banden vorgenommen. In diesem Bereich liegen keine bisher bekannten Tryptophanpigmente, die Fraktion 2 war jedoch bereits in vorgeschalteten Untersuchungen zum Oxidative Burst hemmend in Erscheinung getreten (Heidrich 2010). Die signifikante Hemmung der Phagozytose konnte durch die Banden 2, 4 und 5 verzeichnet werden. Die zusätzlich in diesem System untersuchte Reinsubstanz Pityriazol aus Malassezia furfur besaß zu keinem untersuchten Zeitpunkt einen signifikanten Einfluss auf die Phagozytose von Exophiala dermatitidis-Mel-3 durch neutrophile Granulozyten.Das gepoolte Pigmentgemisch der Sephadex-Fraktionen 4 10 trat in Bezug auf die Phagozytose nicht als signifikant hemmend in Erscheinung. Das darin enthaltene Anthrazit (in Fraktion 6) besitzt demnach nur hinsichtlich des oxidativen Burst Relevanz (Heidrich 2010). Seine strukturelle Aufklärung gelang aufgrund einer nach wie vor zu geringen Ausbeute nicht.Insgesamt wiesen beide Stämme von Exophiala dermatitidis ein zuverlässig reproduzierbares, großes Spektrum an Tryptophanpigmenten auf, die in Form von aufgereinigten Säulenchromatographie-Fraktionen und Einzelbanden eine Hemmung der Phagozytose induzierten. Sie spielen somit möglicherweise eine bedeutende Rolle als Pathogenitätsfaktoren im Rahmen von Exophiala dermatitidis-Infektionen bei Mensch und Tier. The current explorative study is a flow cytometric analysis which examines the influence of the pigments synthesized by Exophilia dermatitidis on phagocytosis of human neutrophile granulocytes in a whole blood assay.Based on the observations of Mayser et al. (1998) showing that the yeast Malassezia furfur was able to generate different indole derivatives by cultivating on a medium only added tryptophan as the single nitrogen source, the capacity to synthesize pigments was meanwhile described of diverse, phylogenetic not related fungi such as Exophilia dermatitidis (Nies 2006; Mayser et. al 2007; Heidrich 2010). This fact resulted in clarification of some recently unknown mechanisms that could play an important role concerning the pathogenesis of these fungi. The aim of the current study was to explore a potential influence of tryptophan pigments synthesized by two strains of Exophilia dermatitidis on the phagocytosis obtaining knowledges about its eventual pathogenic mechanisms.Therefore the wildtype of Exophiala dermatitidis and its mutant Mel-3 were applicated on 1b-agar, in order to induce the pigments. After an incubation of four weeks the pigments were dispensed as raw extract followed by their purification via column and thin layer chromatography. The protocol established already in 1999 by Schnitzler et al. about the exploration of phagocytosis in a whole blood assay was strongly modified reaching the thesis of this study. Therefore the granulocytes were additionally marked by a CD16+-APC-antibody in order to be able to detect them while measuring in the flow cytometric analysis. An inhibition regarding the phagocytosis activity of the granulocytes due to the protective effect of the melanin located in the wildtyp cellwall could be explored in contrast to its mutant Mel-3 in a previous test. Using DMSO as a solvent for the raw extract it could be shown that it already develops per se an inhibitory effect on phagocytosis. Further experimental series with pooled sephadex-fractions of both strains which were dissolved in methanol demonstrated that those of the wildtype could not inhibit the phagocytosis in a significant way. The pooled fractions 1 to 3 of the melanin deficient mutant Mel-3 displayed already ten minutes after incubation a significant inhibition of the phagocytosis. After separating the three fractions it could be indicated that fraction 2 was responsible for that inhibition. Fraction 2 was partitioned by preparative thin layer chromatography into five bands. This area does not include any up to now known tryptophan pigments, though fraction 2 equally appeared to be inhibitory concerning oxidative burst in former studies (Heidrich 2010). This significant inhibition of phagocytosis could be observed owing to the bands 2, 4 and 5. Further examination of the pure substance Pityriazol isolated from Malassezia furfur did not possess any significant influence on the phagocytosis at none of the explored time levels. The pooled mixture of pigments out of the sephadex-fractions 4 to 10 did not appear in an inhibitory way concerning phagocytosis. The pigment Anthrazit , which is included in fraction 6, is therefore just relevant regarding the oxidative burst (Heidrich 2010). Its structural clarification did not succeed due to an underdosed rate of yield.In summary it could be demonstrated that both strains of Exophiala dermatitidis offer a reliable reproduceable, large spectrum of tryptophan pigments, which induced an inhibition of phagocytosis when added as purified column chromatographic fractions and single bands.Therefore they possibly have a significant impact as factors of pathogenity considering Exophiala dermatitidis-infections, both in human beings and animals.