Einfluss reaktiver Sauerstoffspezies auf den zytosolischen Calziumgehalt koronarmikrovaskulärer Endothelzellen in der postischämischen Reperfusion

Abstract

Nach simulierter Ischämie zeigen kardiale Endothelzellen in der Reperfusion, trotz Präsenz von Sauerstoff und Nährstoffen, eine deutliche Verstärkung der zytosolischen Calziumüberladung. Diese Calziumüberladung bewirkt zusammen mit der Vergrößerung der Zellzwischenräume eine Schädigung des umliegenden Gewebes. Frühere Studien am Modell kultivierter kardialer mikrovaskulärer Endothelzellen der Ratte (CMEC) konnten zeigen, dass ein Calzium-Influx und eine Freisetzung aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) diesen weiteren Calziumanstieg auslösen. Ursächlich setzt die PLC den Signalweg der Calziumausschüttung über IP3-Rezeptoren des ER in Gang. Ziel der vorliegenden Studie war die Ursache der PLC-Aktivierung in der postischämischen Reperfusion zu finden und eine mögliche Beteiligung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) an der Calziumüberladung zu ergründen.CMEC wurden in den Experimenten einer 40-minütigen azidotischen Hypoxie ausgesetzt, gefolgt von 40-minütiger Reoxygenation (pH-Wert 7,4; 2,5mM Glukose). Die Ergebnisse wurden mittels fluoreszenzoptischer Methoden (Fluoreszenzfarbstoffe: Fura-2, Mag-Fura, DCF, JC-1) sowie mittels Westernblotanalyse gewonnen. Ergebnisse: In der Reoxygenation konnte durch den Einsatz des Farbstoffes DCF eine Entstehung von Radikalen festgestellt werden, welche sich durch einen mitochondrienspezifischen Radikalfänger MitoQ und durch Inhibition des Komplexes II der mitochondrialen Atmungskette mit TTFA deutlich reduzieren ließ. Dabei zeigten die Inhibition der NADPH-Oxidase und die Hemmung der anderen Komplexe der Atmungskette keine Effekte. Zur Untersuchung der mitochondrialen Funktion wurde der Fluoreszenzfarbstoff JC-1 zur Beobachtung des mitochondrialen Membranpotentials eingesetzt. Die JC-1-Experimente konnten dabei zeigen, dass die Ischämie zu einer Depolarisation führte, die sich in der Reoxygenation nicht vollständig zurückentwickelte. Ein unspezifischer Radikalfänger führte dagegen zu einer leichten Erholung. Die Mag-Fura-Messungen zur Untersuchung des zellulären Energiegehaltes zeigten nach initialer Erholung mit Beginn der Reperfusion einen ATP-Verlust, welcher sich sowohl durch MitoQ als auch durch TTFA reduzieren ließ. Bei Hemmung des Komplexes II und bei Einsatz des Radikalfängers MitoQ kam es darüber hinaus auch zu einer reduzierten Calziumüberladung in der Reoxygenation. Im Westernblot zeigte sich, dass die PLC in der postischämischen Reoxygenation phosphoriliert wurde, was durch verschiedene Radikalfänger verhindert werden konnte. Da spezifische Inhibitoren der src-Kinasen ebenfalls reduzierende Effekte auf die Calziumüberladung der Reoxygenation hatten, wurden diese als Vermittler zwischen den gebildeten Radikalen und der Aktivierung der PLC gesehen. Außerdem konnte die interzelluläre Lückenbildung sowohl durch Inhibition des Komplexes II der mitochondrialen Atmungskette, als auch durch den mitochondrienspezifischen Radikalfänger MitoQ deutlich reduziert werden.Schlussfolgerung: In der postischämischen Reperfusion entstehen Radikale in Komplex II der mitochondrialen Atmungskette. Diese ROS beeinflussen die Energiegewinnung der Zelle und bewirken vermittelt über src-Kinasen eine Aktivierung der PLC. Die aktivierte PLC setzt dann den Signalweg der Calziumausschüttung aus dem ER in Gang, welche wiederum den Calziumeistrom von extrazellulär durch SOC triggert. Eine Reduktion der Radikalentstehung könnte also eine Verminderung der Gewebeschäden zur Folge haben, was für die Therapie eines myokardialen Infarktes von Vorteil wäre. Postischemic reperfusion of coronary microvascular endothelial cells (CMEC) aggravates calcium-overload developed during ischemia. Calcium-overload and disturbance of the endothelial barrier function can cause malfunction and edema of the whole organ. Previous results showed, that calcium-overload in reperfusion is due to initial mobilization of the ER calcium stores followed by calcium-influx from extracellular through store operated channels. It was found, that PLC lead to an IP3-signaling pathway initiating calcium-overload. The aim of this study was to examine whether the reperfusion-induced initiation of the respiratory chain in the presence of oxygen and energy might cause ROS generation within the mitochondria. As a consequence a disturbance of the ATP production occurs and simultaneously ROS may also lead to PLCy activation, causing the reperfusion-induced Ca2+ release from the ER via the IP3-receptor. In experiments CMEC were subjected to 40 min of acidic hypoxia (pH 6.4), followed by 40 min of reoxygenation (pH 7.4; 2,5mM glucose). Results were obtained using fluorescence optical methods (dyes: Fura-2, Mag-Fura, DCF, JC-1) and western blots.Results: During reoxygenation there is an increase in ROS production, which is blocked by the mitochondria-specific scavenger mitoQ and TTFA, a complex II inhibitor. Whereas apocynin, inhibitor of the NADPH-oxidase, had no effect. JC-1 was applied to investigate mitochondrial function, because it illustrates reactions of the mitochondrial membrane potential (MMP). Ischemia induced depolarization of MMP, which could not be restored completely in reoxygenation. Although an unspecific scavenger lead to a slight recovery. To determine cellular energy production, Mag-Fura was applied. Within the first minutes of reoxygenation ATP is produced, but after 40min of reoxygenation a loss of ATP occurs, which is unchanged in the presence of apocynin. But this ATP loss can be blocked by application of MitoQ and TTFA. Furthermore inhibition of complex II of the respiratory chain and reduced ROS production could decrease calcium-overload. Western blot analysis showed that PLCy was phosphorylated during reoxygenation and this phosphorylation was reduced either by application of U73122 or after application of several scavengers. In addition, application of different inhibitors of Src-kinases could also lower calcium-overload, which lead to the declaration that src-kinases arrange between ROS production and activation of PLC. In a final step it became clear, that inhibition of complex II of the respiratory chain with TTFA as well as the mitochondrial-specific scavenger could reduce intercellular gap formation.Conclusion: ROS are generated during reoxygenation within complex II of the mitochondrial respiratory chain and these ROS cause a disturbance of the starting ATP synthesis. The result is an ATP loss similar to ischemic conditions. PLCg is also activated via ROS, initiating the Ca2+ release from the ER. Reduction of ROS production is able to protect the EC against the reperfusion-induced Ca2+ overload pointing to new possibilities in the therapy of CMEC after myocardial infarct.