NFkappa B, Caspase 3 und Cytochrom c Oxidase : Licht- und elektronenmikroskopische, immunhistochemische sowie biochemische Untersuchungen am GalN/TNF-Alpha-Modell der Maus

Abstract

Ziel dieser kinetischen Studie war die Untersuchung der Veränderungen der Hepatocyten von GalN sensibilisierten TNF-a-behandelten Mäusen in einem Zeitraum von 48 Stunden. Der apoptotische Effekt von TNF-a wurde durch die Blockierung der Synthese cytoprotektiver Proteine mittels GalN erzielt. Diese Proteine verhindern physiologisch eine von TNF-a induzierte Apoptose. Besonderer Wert wurde auf die Untersuchung der hepatozellulären Apoptose gelegt. Im ersten Teil der Arbeit wurden in Form einer Literaturübersicht die Morphologie und die Mechanismen der Apoptose beschrieben. Weiterhin wurde auf einige Proteine, die an diesem Prozeß beteiligt sind, näher eingegangen, wobei der Transkriptionsfaktor NF-kB und sein Inhibitor I-kB im Vordergrund stehen. In diesen Untersuchungen wurde Mäuselebergewebe nach einer standardisierten Perfusionsfixierung mit 4% Paraformaldehyd oder 0,25% Glutaraldehyd fixiert und in unterschiedlichen Medien für Licht-, Elektronen-, Fluoreszenzmikroskopie und für Immunhistochemie eingebettet. Durch die elektronenmikroskopische Untersuchung konnten die präapoptotische und apoptotische Veränderungen der Mitochondrien und des Zellkernes dargestellt werden. 3 1/2 Stunden nach GalN/TNF-a Behandlung zeigten apoptotische Hepatocyten Mitochondrien mit einer Ruptur der äußeren Membran, durch die die innere Membran in Form einer Hernie hervorquoll. Ebenfalls traten die Veränderungen im Zellkern auf, die durch Chromatinkondensierung am Kernrand und schließlich 4 1/2 Stunden nach GalN/TNF-a Behandlung durch Bildung der apoptotischen Körperchen charakterisiert werden. Nekrosen wurden vermehrt nach acht Stunden identifiziert und begleiteten dabei die apoptotischen Veränderungen, die ihrerseits nach 24 Stunden verschwanden. Nach 48 Stunden waren kaum noch nekrotische Herde sichtbar und als ein Zeichen der Leberregeneration traten vereinzelt Mitosen auf. Der nukleäre Transkriptionsfaktor-kB (NF-kB) befindet sich in inaktiver Form an Proteine der I-kB Familie gebunden im Cytoplasma. Eine Aktivierung mit anschließender Translokation in den Zellkern wurde durch TNF-a erreicht. Die Aktivierung von NF-kB wurde 30 min nach Behandlung immunhistochemisch und mittels Western-Blotting nachgewiesen. Die Tendenz war bis 2 1/2 Stunden steigend. Danach nahm NF-kB ab, war aber nach 4 1/2 Stunden im Zellkern mit 30% im Vergleich zu den Kontrollen immer noch stark erhöht. Die Inhibtorproteine I-kBa und I-kBb sind als Regulatoren des Transkriptionsfaktors, obwohl sie der gleichen Familie zugehören, in ihrer Zusammensetzung und Funktion doch sehr verschieden. Während I-kBa instabil ist, was die Komplexbildung mit NF-kB betrifft, ist die Verbindung NF-kB/I-kBb durch die Maskierung beider NLS-Sequenzen ('nuclear localization signal') wesentlich stärker. I-kBa konnte dementsprechend schon nach 30 min im Kern nachgewiesen werden, I-kBb hatte dagegen bis 4 1/2 Stunden nach Behandlung eine ausschließlich cytoplasmatische Lokalisation. Nach 3 1/2 Stunden stieg die Caspase 3-Aktivität um das fünffache im Vergleich zu den Kontrolltieren an. Die Messung der Cytochrom c Oxidase-Aktivität in der mitochondrialen Fraktion bestätigte die licht- und elektronenmikroskopischen Ergebnisse. Sie fiel 2 1/2 Stunden nach Behandlung ab, was durch eine erhöhte Permeabilität der inneren Mitochondrienmembran erklärt wurde. Ein Anstieg nach 4 1/2 Stunden wurde auf das Nachlassen der TNF-a-Wirkung und der Aktivierung der Atmungskette zurückgeführt. Die nekrotischen Veränderungen verursachten nach 8 Stunden ein erneutes Absinken der Cytochrom c Oxidase-Aktivität. Die Regeneration der Hepatocyten wurde nach 48 Stunden durch ein erneutes Ansteigen dieser, charakterisiert. Zu diesem Zeitpunkt war sie sogar höher als in den Kontrollen. Dies unterstreicht den Zusammenhang zwischen GalN/TNF-a induzierten Effekten: auf der einen Seite die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB und der 'Kampf' der Zelle ums Überleben mit dem Anstieg der Cytochrom c Oxidase-Aktivität, auf der anderen Seite die Apoptose mit ihren morphologischen Veränderungen, der Aktivierung der Caspase 3 und der Einleitung des Zelltodes. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigen, dass die Translokation von NF-kB zurück in das Cytoplasma nach GalN/TNF-a-Behandlung gestört ist. Ungefähr 30% von NF-kB verbleibt in den Zellkernfraktionen und wurde ausschließlich im Heterochromatin apoptotischer Hepatocyten nachgewiesen. Außerdem war das Erscheinen der apoptischen Hepatocyten mit einem enormen Anstieg der Caspase 3-Aktivität verbunden. The aim of this kinetic study was to analyse the alterations of hepatocytes of GalN sensitized TNF-a-treated mice during 48 hours. The apoptotic effect of TNF-a was achieved by blocking the synthesis of cytoprotective proteins using GalN. These proteins prevent physiologically the apoptosis induced by TNF-a. The main focus of this study was the analysis of the hepatocellular apoptosis. In the first part the mechanisms and the morphology of apoptosis have been reviewed in a survey of literature. The roles of transcription factor NF-kB and its inhibitor I-kB together with some proteins, which are involved in this induction process were of special interest. In our morphologic studies mouse liver tissue was fixed using a medium containing 4% paraformaldehyde or 0,25% glutaraldehyde. The tissue was embedded for light-, electron- and fluorescence microscopy as well as for immunhistochemistry. By electron microscopic examination pre-apoptotic and apoptotic changes of mitochondria and nuclei have been studied. At 3 1/2 hours after GalN/TNF-a administration apoptotic hepatocytes contained mitochondria with a rupture of the outer membrane and herniation of the inner membrane through those gaps. Changes were also observed in nuclei, characterized by heterochromatin condensation along the nuclear envelope followed by the formation of apoptotic bodies 4 1/2 hours after GalN/TNF-a stimulation. Necrosis appeared after eight hours, accompanied at the same time by apoptotic changes, which disappeared after 24 hours. After 48 hours, only few necrotic changes were seen and isolated mitosis appeared as a sign of liver regeneration. The inactive nuclear transcription factor-kB (NF-kB) bound to proteins of the I-kB family is located in cytoplasm. The activation followed by the translocation into the nucleus was induced by TNF-a. In the nucleus NF-kB was detectable 30 min after stimulation by immunohistochemistry and Western-Blotting. The translocation into the nucleus increased until 2 1/2 hours, decreasing thereafter. However, even after 4 1/2 hours it was still elevated in the nucleus by about 30% in comparison to the control. The inhibtor proteins I-kBa and I-kBb differ in their structure und function as regulators of the transcription factor, although they belong to the same protein family. Whereas I-kBa shows instability in binding to NF-kB, the binding of NF-kB/I-kBb is considerably stronger due to masking of both NLS-sequences (nuclear localization signals). Accordingly I-kBa was detected in the nucleus already 30 min after stimulation. In contrast, I-kBb showed an exclusively cytoplasmatic localisation during 4 1/2 hour period after stimulation. After 3 1/2 hours caspase 3-activity increased more than five fold in comparison to control animals. The measurement of cytochrome c oxidase-activity in the mitochondrial fraction confirmed the light- and electron microsopic results. An increase of the activity after 4 1/2 hours was explained by the decrease of the TNF-a-effect and by the activation of the respiratory chain. The necrotic changes seen 8 hours after administration caused a decrease of the cytochrome c oxidase-activity. The regeneration of hepatocytes after 48 hours was characterized by an increase of cytochrome c oxidase-activity. At this time point the activity was even higher than the controls. This alterations emphasizes the complex relation between the effects induced by GalN/TNF-a: the activation of the transcription factor NF-kB and the 'struggle' of the cell for survival with an increase of cytochrome c oxidase-activity on one hand and induction of cell death on the other hand with apoptosis and activation of caspase 3. The results of the present study indicate, that the shuttle of NF-kB back to the cytoplasm is disturbed after GalN/TNF-a treatment. Approximately 30% of NF-kB remained in the nuclear fractions and could be observed exclusively in the heterochromatin of the nuclei of apoptotic hepatocytes. In addition the appearance of apoptotic hepatocytes was correlated with an enormous increase of caspase-3 activity.