Neonatale Alloimmunthrombozytopenie : die Entwicklung von rekombinanten alpha IIb beta 3 -Integrin Isoformen (HPA-1 Antigene) und funktionelle Untersuchung einer seltenen Punktmutation auf beta 3 -Integrins (Oe a -Antigen)

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird eine Methode zum Nachweis von Alloantikörper gegen das thrombozytäre Oberflächenglykoprotein GPIIb/IIIa als Ursache der neonatalen Alloimmunthrombozytopenie (NAIT) vorgestellt. Mit Hilfe molekularbiologische Methoden wurden stabile Transfektanten mit HPA-1a, HPA-1b und Oea-Antigenen des GPIIb/IIIa entwickelt. Diese können für die Detektion von Alloantikörper bei neonataler Alloimmunthrombozytopenie verwendet werden. Darüberhinaus können solche Transfektanten für die Analyse der Funktion von GPIIb/IIIa-Rezeptor eingesetzt werden. Aus der Analyse von natürlichen Punktmutationen (wie zum Beispiel Oea) lässt sich weitere Information über die Struktur des GPIIb/IIIa-Rezeptors ableiten. Weitere Anstrengungen in der Zukunft werden sein, gereinigte Antigene aus solchen Transfektanten in großen Mengen zu isolieren und in einem einfachen Solid-Phase-Testsystem einzusetzen. Ein solches Testsystem würde eine schnelle Diagnose der Alloimmunthrombozytopenien ermöglichen, die für die richtige Therapiestrategie der Kinder mit der neonatalen Alloimmunthrombozytopenie unabdingbar ist. Auf dem tiermedizinischen Bereich besteht bezüglich der Immunthrombozytopenien noch ein erheblicher Bedarf an Grundlagenforschung. Es ist anzustreben, dass mit den heutigen Kenntnissen und Arbeitsmethoden aus der Humanmedizin die Möglichkeit genutzt wird, bei Tieren die molekulargenetischen Grundlagen der Antigenstrukturen auf Thrombozyten zu analysieren und darauf basierend neue Ansätze für die pränatale und postnatale Diagnostik und Therapie in der Veterinärmedizin zu entwickeln. Die Aufklärung der molekularen Grundlagen der NAIT bei Tieren würde auch die Möglichkeit eröffnen, Tiermodelle zu etablieren, um die Pathomechanismen der Alloimmunthrombozytopenie besser zu verstehen und die Vorsorge und Therapie bei Kindern mit NAIT zu verbessern. It is well known that alloantibodies against the platelet glycoprotein IIb/IIIa polymorphism (HPA-1a and HPA-1b) as a major cause of neonatal alloimmune thrombocytopenia (NAIT). However, the laboratory diagnostic of these antibodies is hampered by the use of serological technique, which is still cumbersome and time consuming. Here, with the help of molecular biological methods we developed stable transfectants expressing HPA-1a and HPA-1b epitopes. We could demonstrate that these transfectants were able to differentiate anti-HPA-1a and anti-HPA-1b antibodies in flowcytometry. Thus, in the future such transfectant can be used directly for the detection of HPA-1a antibody. These stable cell lines represent a source for production of recombinant HPA-1 antigens and will help us to develop simple serological assay (solid phase assay) for the detection of anti-HPA. Such test system will help us to accelarate the diagnosis of alloimmune thrombocytopenia, which is necessary for the adequate therapy of the children with neonatal alloimmune thrombocytopenia. Futhermore, by the development of stable transfectant expressing Oea alloantigen, we were able to demonstrate that the deletion of aminoacid 611 in the cysteine-rich region of GPIIIa is responsible for the epitope formation of Oea, but has no influence on the function of GPIIb/IIIa receptor. Analysis of natural point mutations (e.g. Oea) will provide us further information about the structure of important functional region of the GPIIb/IIIa receptor. The transfer of this knowledge in veterinary medicine concerning the immune thrombocytopenia is a challenge for the research, which is necessary for the development of animal models to study the pathophysiology and therapy of NAIT.