Entwicklung und Anwendung enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis von Alternariol

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Anwendung von zwei Enzymimmuntests zum Nachweis von Alternariol auf der Basis polyklonaler- bzw. monoklonaler Antikörpern gegen dieses Mykotoxin (pAk- bzw. mAk-EIA). Zur Herstellung von Alternariol-Protein-Konjugaten wurde Alternariol mittels der Mannich- Kondensations-Reaktion an keyhole limpet hemocyanin (KLH) bzw. an bovines Serumalbumin (BSA) gekoppelt. Zur Gewinnung polyklonaler Antikörper wurden Kaninchen mit Alternariol-KLH immunisiert. Die Überprüfung der gewonnen Antiseren zeigte, dass alle Tiere spezifische Antikörper gegen Alternariol bildeten. Unter Berücksichtigung der Spezifität und Sensitivität wurden die geeignetsten Antiseren für die weitere Testentwicklung verwendet. Parallel hierzu wurden unter Verwendung des in dieser Arbeit hergestellten Immunogens an der LMU München monoklonale Antikörper gegen Alternariol produziert und für diese Arbeit zur Verfügung gestellt. Mit beiden Testsystemen konnte Alternariol im unteren pg/ml-Bereich nachgewiesen werden. Zur Entwicklung eines kompetitiven direkten EIAs wurde Alternariol-BSA mittels reduktiver Alkylierung an das Enzym Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt. Unter der Verwendung eines Anti-Alternariol-Antiserums und des Alternariol-BSA-HRP-Konjugates konnte ein Testsystem erstellt werden, das den Nachweis von Alternariol mit einer Nachweisgrenze von 17 ng/ml erlaubte. Für die Entwicklung eines kompetitiven indirekten EIAs wurde das mittels Mannich- Kondensationsreaktion hergestellte Alternariol-BSA-Konjugat eingesetzt. Unter der Verwendung von polyklonalen bzw. monoklonalen Antikörpern konnten zwei indirekte EIAs etabliert werden. Mit einer mittleren Nachweisgrenze der Alternariol-Standardkurven von 35 ± 6,9 pg/ml (mAk-EIA) und 59 ± 16 pg/ml (pAk-EIA) sind beide Tests sehr empfindlich für Alternariol. Zur Bestimmung der Spezifität der beiden enzymimmunologischen Verfahren wurden die Kreuzreaktionen anderer Alternaria-Toxine getestet. Beide EIAs sind spezifisch für Alternariol, die relativen Kreuzreaktionen mit anderen Alternaria-Toxinen (Altenuen, Alternariolmonometyhlether und Tenuazonsäure) liegen unter 1 %. In einer ersten Anwendungsstudie wurden Proben ausgesuchter Lebensmittelgruppen mit den beiden indirekten EIAs untersucht. Die 119 analysierten Proben setzten sich aus Apfelsaft (n = 44), Apfelmus (n = 10), Erdbeerkonfitüre (n = 10), Tomatenketchup (n = 18), Tomatenmark (n = 10), Tomatensaft (n = 16) und Weißwein (n = 11) zusammen. Die Proben wurden entweder mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt und direkt analysiert (Apfelsaft, Wein, Tomatensaft) oder durch eine Flüssig-Flüssig-Extraktion aufgereinigt. Die Nachweisgrenze für Alternariol in Tomatenmark betrug 2 Mikrogramm/kg, in allen anderen Probenmatrices konnte eine Nachweisgrenze von 1 Mikrogramm/kg bzw. Mikrogramm/l erreicht werden. Die mittleren Wiederfindungsraten von Alternariol in künstlich kontaminierten Proben im Konzentrationsbereich von 1 10 Mikrogramm/kg lagen bei 43 80 % (mAk-EIA) bzw. bei 60 98 % (pAk-EIA). Ein hoher Prozentsatz der Proben (mAk-EIA 75 %, pAk-EIA 46 %) ergab positive Ergebnisse für Alternariol. Die nachgewiesenen Alternariol-Konzentrationen lagen zwischen 1 9 Mikrogramm/kg, in Tomatenmark wurden etwas höhere Alternariol-Gehalte festgestellt (13 Mikrogramm/kg). Bei der Untersuchung von sichtbar mit Schwärzepilzen befallenen Tomaten konnten Alternariol-Konzentrationen bis 37 mg/kg nachgewiesen werden. Die Übereinstimmung der Ergebnisse der beiden indirekten EIAs war akzeptabel und korrelierte auch mit durchgeführten HPLC-Analysen. Die in dieser Arbeit entwickelten Testsysteme ermöglichen somit einen schnellen und einfachen Nachweis von Alternariol im niedrigen Mikrogramm/kg-Bereich und eignen sich daher gut als Routineverfahren zum Nachweis von Alternariol in Lebensmitteln. The present study describes the development and application of two enzyme immunoassays for the detection of alternariol with monoclonal (mAb) and polyclonal (pAb) antibodies, respectively (mAb-EIA and pAb-EIA). For synthesis of the alternariol-protein-conjugate, alternariol was linked to keyhole limpet hemocyanin (KLH) as well as to bovine serum albumin (BSA) by the Mannich condensation reaction. Moreover, polyclonal antibodies were produced in rabbits by immunisation with alternariol-KLH-conjugate. The characterisation of the produced antisera showed, that all rabbits produced specific antibodies against alternariol. The antisera with the best sensitivity and specificity were used to establish an enzyme immunoassay. In parallel, the Alternariol- KLH-conjugate was used to generate monoclonal antibodies (LMU München), which were provided for this work. EIAs from both antibodies (mAb and pAb) were highly sensitive for alternariol with a detection limit in the low pg/ml-range. To develop a competitive direct EIA, alternariol-BSA was coupled to horseradish peroxidase (HRP) by applying reductive alkylation. In combination with an anti-alternariol-antisera this altenariol-BSA-HRP-conjugate achieved a detection limit of 17 ng/ml for alternariol. The same alternariol-BSA-conjugate was used to develop a competitive indirect EIA with polyclonal as well as monoclonal antibodies. Both EIAs were highly sensitive, with detection limits of 35 ± 6.9 pg/mL (mAb-EIA) and 59 ± 16 pg/mL (pAb-EIA), respectively. To determine the specificity of these two indirect EIAs, the cross-reactivities with other Alternaria-mycotoxins (altenuene, alternariolmonomethylether and tenuazonicacid) were tested. Both EIAs are very specific for alternariol with cross-reactivities less than 1%. For application studies samples of certain categories of food were examined with both indirect EIAs. The 119 analysed samples consisted of apple juice (n = 44), applesauce (n = 10), strawberry jam (n = 10), tomato ketchup (n = 18), tomato paste (n = 10), tomato juice (n = 16) und white wine (n = 11). Sample materials were either analysed directly after dilution with phosphate buffered saline (apple juice, wine, tomato juice), or purified by liquid-liquidextraction. A detection limit of 1 microgram/kg was demonstrated for all sample materials beside tomato paste, where 2 microgram/kg were achieved. Mean recoveries of alternariol at spiking levels of 1 10 microgram/kg were 43 80% in mAb-EIA, and 60 98% in pAb-EIA, respectively. A high percentage (75 % in mAb-EIA, 46 % in pAb-EIA) of all samples was positive for alternariol. Standard alternariol values were in the range of 1-9 microgram/kg with the highest concentration in tomato paste (13 microgram/kg). Tomatoes with black mold spots contained very high alternariol concentrations up to 37 mg/kg. The overall consistency of both indirect EIAs was acceptable and the EIAs results correlated very well with those obtained by the HPLC. Both EIAs developed in this study allow a fast and easy detection of alternariol in the low microgram/kg range. Therefore, both tests are suitable for the routine analysis of alternariol in food samples.